Using Charge Detection Mass Spectrometry with an Electrostatic Linear Ion Trap and Heated Inlet for the Analysis of Protein Complexes

Význam tématu

Studium velkých nativních proteinových komplexů je nezbytné pro pochopení biologických mechanismů a vývoj nových léčebných přístupů. Tradiční hmotnostní spektrometrie naráží na omezení spojená s heterogenitou, přítomností aduktů a překrývajícími se nabitostními stavy. Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS) s elektrostatickou lineární iontovou pastí (ELIT) a zahřívaným vstupem představuje inovativní přístup, který umožňuje přímé stanovení m/z i náboje jednotlivých iontů a tím i přesnou determinaci jejich hmotnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo demonstrovat schopnosti komerčního systému Waters™ Xevo™ CDMS vybaveného zahřívaným vstupem při analýze dvou modelových soustav: proteasomu 20S a regulatorního komplexu Bpa:HspR. Studie se zaměřila na:

• Stanovení přesné hmotnosti intactního 20S jádra a sledování teplotně indukované disociace alfa-subjednotek.
• Určení stechiometrie dodekamerního aktivátoru Bpa v apo a HspR-vázané formě a vliv tepelné aktivace na disociaci komplexu.

Použitá instrumentace

• Prototype ELIT-based CDMS systém s 500 ms doby záchytu iontů.
• Zahřívaný vstup nastavený až na 300 °C pro termickou aktivaci komplexů.
• nESI zdroj pracující v pozitivním iontovém režimu.
• Software pro Fourierovu transformaci signálu a generování m/z, náboje a hmotnostních histogramů.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza intactního 20S CP prokázala experimentální hmotnost (~729 kDa) v souladu s teoretickou (720 kDa). Při zahřátí vstupu nad 250 °C se projevila asymetrická ztráta alfa-subjednotek a redukce náboje, spolu s odstraněním nespecifických aduktů, což vedlo k vynikající shodě s očekávanou hmotností.
Pro komplex Bpa:HspR CDMS odhalila přítomnost dvou molekul HspR na dodekameru Bpa (pozorovaná hmotnost 257,3 kDa vs. teoretická 255,6 kDa). Tepelná aktivace vyvolala vypuzení HspR a redukci průměrného náboje z 31,9 na 18,6, přičemž apo Bpa zůstala intaktní.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé měření hmotnosti jednotlivých iontů řeší problém překrývajících se nabitostních stavů.
• Zahřívaný vstup zlepšuje desolvataci a umožňuje řízenou disociaci komplexů.
• Metoda umožňuje studium stability a konformací nemocensky relevantních biomolekulárních shluků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření CDMS do běžných laboratoří strukturální biologie a farmacie. Kombinace s technikami jako cryo-EM či ion mobility MS by mohla přinést komplexnější pohled na dynamiku a složení velkých komplexů. Další vylepšení zahrnují automatizaci termické aktivace, vyšší citlivost pro viry a virusopodobné částice a integraci do pracovních postupů QA/QC biotechnologických produktů.

Závěr

CDMS s ELIT a zahřívaným vstupem představuje silný nástroj pro přesnou charakterizaci velkých nativních proteinových komplexů. Tepelná aktivace zvyšuje hmotnostní přesnost a odhaluje detaily disociace a konformací, což významně rozšiřuje možnosti studia biomolekulárních shluků v biomedicínském výzkumu a průmyslu.

Reference

• Hogan JA, Jarrold MF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2018; DOI:10.1021/jasms.3c00177
• Bolten J et al. Structure. 2016; DOI:10.1021/j.str.2016.10.008
• Hu X et al. J. Biol. Chem. 2018; DOI:10.1074/jbc.RA117.001471