Implementation of MS1 based real–time retention time adjustment on a hybrid Orbitrap mass spectrometer for directed and targeted proteomics

Význam tématu

V cílené proteomice se dlouhodobé cohort studie potýkají s proměnlivostí retenčních časů způsobenou stárnutím kolony a odchylkami v gradientu. Precizní korekce retenčních časů v reálném čase umožňuje zkrácení časových oken pro akvizici peptidů, zvýšení počtu sledovaných cílových analyz a spolehlivou kvantifikaci bez potřeby standardních peptidek.

Cíle a přehled studie

Studie představuje implementaci metody založené na MS1 datech pro real-time korekci retenčních časů na modifikovaném Orbitrap Exploris 480. Účel metody spočívá ve vytvoření referenčního běhu, následném porovnávání s probíhajícími běhy a aplikaci korekce on-the-fly pro plánování cílených i řízených experimentů.

Použitá metodika

Metoda vychází z následujících kroků:

• Akvizice pravidelných MS1 spekter v referenčním běhu.
• Vytvoření binned a komprimované referenční matice pro rychlé křížové korelace.
• V reálném čase se každé MS1 spektrum zpracuje stejně a porovná s referenčními spektry v časovém okně ±10 min.
• Maximální pozice křížové korelace určuje aktuální posun retenčního času.
• Výpočet levého a pravého FWHM odhadu poskytuje nejistotu korekce, která rozšiřuje počáteční okna pro zahrnutí cílových iontů.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 480 (modifikovaný) pro MS1 a MS2 akvizice.
• UHPLC systém Vanquish Neo s EASY-Spray kolonkou ES906 (2 µm, 150 µm × 150 mm).
• Rodiny výměnných gradientů simulujících posuny retenčních časů (30 min, 1 µL/min).

Hlavní výsledky a diskuse

• Při testu s PRTC standardy metody korekce přesně sledovaly posuny (rozdíl <1 s), korelační křivky odpovídají skutečným posunům gradientů.
• V reálné vzorku HeLa digesátu bylo analyzováno ~2500 peptidů, pokrytí apexů >95 % pro všechna počáteční okna (6–30 s).
• Maximální rozšíření časového okna bylo 6–9 s, přesto zůstává vysoká selektivita a citlivost MS2 akvizice.
• Výpočetní výkon metody umožňuje aplikaci bez významného zpomalení cyklu analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace nutnosti přidávání externích standardů pro RT kalibraci.
• Zvýšení počtu sledovaných cílových peptidů díky zúžení RT oken.
• Zlepšení reprodukovatelnosti a kvantitativní přesnosti v dlouhodobých studiích.
• Aplikace v QA/QC standardech, klinické i průmyslové proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na multiplexní experimenty s izotopově značenými reageny (TMT, SILAC).
• Automatizované sledování kolony a adaptivní změna gradientu během běhu.
• Integrace do softwarových platforem pro proteomickou analýzu a řízení kvality.
• Použití v metabolomice nebo glykoproteomice s obdobnými principy RT korekce.

Závěr

Metoda MS1-založené real-time korekce retenčních časů na Orbitrap Exploris 480 prokázala vysokou spolehlivost a přesnost za různých chromatografických podmínek bez potřeby syntetických standardů. Umožňuje zkrácení akvizičních oken, zlepšení reprodukovatelnosti a rozšíření multiplexu cílených experimentů.

Reference

1. Philip M. Remes, Ping Yip, Michael J. MacCoss. Highly Multiplex Targeted Proteomics Enabled by Real-Time Chromatographic Alignment. Analytical Chemistry. 2020;92(17):11809-11817.