High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid mass spectrometer for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Precizní kvantifikace proteomů pomocí data-independent acquisition (DIA) bez štítků umožňuje získat komplexní a reprodukovatelné informace o proteinové expresi, což je klíčové pro výzkum biologických procesů, biomarkerů a QA/QC analýzy. Výhoda datového přístupu DIA spočívá v minimalizaci chybějících hodnot a lepší opakovatelnosti oproti tradičním DDA metodám.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit workflow Velocity DIA na hmotnostním spektrometru Orbitrap Ascend Tribrid v režimu DIA pro label-free kvantifikaci, optimalizovat délky gradientu (60, 30 a 9 minut) a integrovat volitelnou separaci FAIMS Pro i automatizovanou přípravu vzorků pomocí platformy AccelerOme.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje automatizovanou přípravu směsí standardních digestů (HeLa, E. coli, kvasinky) na Thermo Scientific AccelerOme. Peptidy se injektují přímo na 50cm μPAC Neo kolonu v systému Vanquish Neo UHPLC (průtok 350 nL/min) a separují se gradienty 9, 30 nebo 60 minut. Detekce probíhá na Orbitrap Ascend Tribrid MS v režimu DIA, často s FAIMS Pro rozhraním. Analýza dat je prováděna softwary Spectronaut (directDIA), Proteome Discoverer se CHIMERYS a DIA-NN.

Hlavní výsledky a diskuse

• 30min gradient s FAIMS: identifikováno >7000 proteinových skupin a >47 000 peptidů s CV ~5 %.
• 60min gradient: prohlubeno pokrytí proteomu na ~7800 proteinů a >76 000 peptidů.
• 9min ultrarychlý režim: Max ID ≥5400 proteinů, Max Quan CV ~6 %.
• Zvýšení nálože na 500 ng: >8100 proteinů s CV ~4 %.
• Knihovnové vyhledávání přidalo 3–10 % identifikací, nejvíce u nejkratších gradientů.
• Quantitativní přesnost blízko teoretickým poměrům s úzkou distribucí datových bodů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje flexibilní kompromis mezi hloubkou proteomového pokrytí a rychlostí analýzy. Díky automatizaci je minimalizována variabilita a zvýšena průchodnost vzorků, což usnadňuje aplikace ve výzkumu, průmyslové QA/QC a biomarkerových studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zvýšení skenovací rychlosti, vylepšená akviziční schémata a integrace AI-podpory pro analýzu dat. Rozšíření na studium post-translačních modifikací, single-cell proteomiku a využití iontové mobility či nových materiálů kolonek může dále prohloubit biologické poznatky.

Závěr

Velocity DIA workflow na Orbitrap Ascend v kombinaci s μPAC Neo kolonkou a Vanquish Neo UHPLC poskytuje robustní, výkonnou a škálovatelnou platformu pro label-free kvantitativní proteomiku, vhodnou od hlubokých průzkumných analýz až po ultrarychlé screeningové režimy.

Reference

• Kevin Yang et al., High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid MS for accurate label-free quantitation, Thermo Fisher Scientific, 2024.