High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Label-free kvantitativní proteomika je klíčová pro pochopení proteinové exprese v biologických systémech bez nutnosti značení. Data-independent acquisition (DIA) poskytuje vyšší reprodukovatelnost a méně chybějících hodnot oproti tradičnímu DDA. Optimalizace DIA metod umožňuje dosáhnout jak hlubokého pokrytí proteomu, tak vysokého vzorkovacího výkonu, což je zásadní pro velkokapacitní klinické studie či průmyslovou kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout „Velocity DIA“ workflow pro Orbitrap Ascend Tribrid MS v kombinaci s Vanquish Neo UHPLC systémem a μPAC Neo 50 cm kolonou. Studie zkoumala tři gradienty (60 min, 30 min a 9 min) a dvě strategie zpracování dat: Max ID pro maximální počet identifikací a Max Quan pro nejlepší kvantitativní přesnost při ultra-vysokém průtoku.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky obsahovaly HeLa proteinový digest a tří-proteomové směsi (E. coli, Saccharomyces cerevisiae a lidský HeLa digest). Separace probíhala na 50 cm μPAC Neo kolonce při 350 nL/min. MS analýza: Thermo Scientific Orbitrap Ascend Tribrid s FAIMS Pro rozhraním, snímkování v DIA režimu. Pro zpracování dat byly použity Spectronaut (directDIA), DIA-NN a Proteome Discoverer s CHIMERYS.

Hlavní výsledky a diskuse

• 60 min gradient identifikoval přes 8 100 proteinových skupin z 500 ng vzorku (CV ~4 %).
• 30 min gradient dosáhl >7 000 proteinů a >47 000 peptidových identifikací při CV ~5 %.
• 9 min ultra-rychlý gradient umožnil detekci >5 400 proteinů (Max ID) a zachoval kvantitativní přesnost ~6 % CV (Max Quan).
• FAIMS Pro mírně snížil počet identifikací peptidů, ale zvýšil počet proteinových skupin o průměrných 5 %.
• Při vyšším dávkování vzorku lze dále prohloubit pokrytí proteomu bez výrazné ztráty kvality kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyvážené řešení mezi hloubkou proteomové pokryvnosti a rychlostí analýzy.
• Možnost automatizace přípravy vzorků pomocí platformy AccelerOme pro snížení variability.
• Vhodné pro rutinní analýzy v klinických laboratořích, farmaceutickém výzkumu či QA/QC v průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s dalšími omickými technologiemi a multi-omics přístupy.
• Další zkracování gradientů při zachování robustní kvantifikace.
• Rozvoj umělé inteligence pro pokročilou interpretaci DIA dat.
• Širší nasazení v monitorování biomarkerů a personalizované medicíně.

Závěr

Velocity DIA na Orbitrap Ascend Tribrid představuje robustní a flexibilní platformu pro label-free kvantitativní proteomiku s možností volby mezi maximálním pokrytím proteomu a vysokou přesností kvantifikace. Výsledky potvrzují vysokou reprodukovatelnost a efektivitu při zkrácených mírách analýzy.