High-throughput high-resolution data-independent acquisition workflow on an Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Quantitativní proteomika založená na přístupu data‐independent acquisition (DIA) je klíčová pro důkladnou analýzu komplexních vzorků. Tento přístup zajišťuje robustní identifikaci a přesnou kvantifikaci proteinů s minimem chyb a náhodného vynechávání, což je nezbytné pro spolehlivé biologické závěry.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a otestovat workflow Velocity DIA na hmotnostním spektrometru Orbitrap Exploris 480 pro label‐free kvantifikaci (LFQ). Autoři porovnali tři délky chromatografických gradientů (60, 30 a 9 minut) a zhodnotili dopad FAIMS Pro interface, rozdílné zatížení vzorku a využití knihoven při zpracování dat.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HeLa digest, tří‐proteomová směs (HeLa, E. coli, kvasnice) v definovaných poměrech.
Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC se 50 cm µPAC Neo kolónou, průtok 350 nL/min, gradienty 9, 30, 60 min.
Mass spectrometry: Orbitrap Exploris 480 v DIA režimu, volitelně s FAIMS Pro interface.
Automatizace: AccelerOme platforma pro přípravu vzorků.
Software: Spectronaut (directDIA), DIA‐NN, Proteome Discoverer s CHIMERYS.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové poznatky:

• 60min gradient: identifikace ~7 200 proteinů a >60 000 peptidů, CV ~4 % při 500 ng zátěži.
• 30min gradient: >6 300 proteinů a >40 000 peptidů, CV ~5 %.
• 9min gradient: Max ID metoda >5 500 proteinů, Max Quan metoda kompromis s CV ~6 %.
• FAIMS Pro interface zvýšil počet identifikovaných proteinů o ~5 %.
• Vyšší nálož (500 ng) vedla k >7 400 identifikacím proteinů s CV ~4 %.
• Library‐based search v DIA‐NN a Spectronaut přidal 3–10 % nových identifikací.

Workflow prokázal vysokou robustnost, reprodukovatelnost a flexibilitu nastavení dle potřeb různých aplikací.

Přínosy a praktické využití metody

Výhody workflow Velocity DIA:

• Vysoká propustnost analýz s hlubokým pokrytím proteomu.
• Omezení chyb spojených s ruční manipulací díky automatizaci.
• Možnost analýzy vzorků od nízkých po vysoké koncentrace s konstantní kvalitou dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování může zahrnovat:

• Integraci strojového učení a AI pro rychlejší analýzu a interpretaci dat.
• Vývoj modulárních metod pro single-cell a multiplexní proteomiku.
• Využití v klinických studiích a průmyslové QA/QC pro průběžné monitorování proteinových markerů.

Závěr

Workflow Velocity DIA na Orbitrap Exploris 480 splňuje náročné požadavky na hloubku proteomického pokrytí, kvantitativní přesnost a rychlost analýzy. Flexibilita délky gradientu a možnost využití FAIMS zvyšují univerzálnost metody pro široké spektrum biologických a průmyslových aplikací.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 480 v režimu DIA s FAIMS Pro interface.
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC se 50 cm µPAC Neo kolónou.
• AccelerOme automatizovaný systém pro přípravu vzorků.
• Softwarové nástroje: Spectronaut, DIA‐NN, Proteome Discoverer s CHIMERYS.