Simultaneous Quantitation and Untargeted Discovery (SQUAD) workflow using multiple fragmentation techniques for quantitation and characterization of trace level nitrosamine in biological matrices

Význam tématu

N-Nitrosaminy představují skupinu vysoce karcinogenních nízkomolekulárních sloučenin, které se mohou vyskytovat v potravinách, vodě, kosmetice či jako nečistoty ve farmaceutických produktech. Přesné stanovení jejich stopových koncentrací v biologických matricích je klíčové pro hodnocení expozice, riziko vzniku onemocnění a zajištění kvality surovin a finálních výrobků.

Cíle a přehled studie

Cílem předložené studie bylo vyvinout a optimalizovat SQUAD (Simultaneous Quantitation and Untargeted Discovery) workflow umožňující současnou cílenou kvantifikaci známých nitrosaminů a neřízenou detekci neznámých látek v jediné chromatograficko-hmotnostní analýze. Metodika byla ověřena na spikovaných extraktech lidské moči a lidského séra.

Použitá metodika

Pro přípravu vzorků byly standardy směsi EPA 521 ve ředění od 100 fg/mL do 25 ng/mL rozpustné v methanolu aplikovány do ředěných extraktů lidské moči a séra. Chromatografická separace probíhala na analytickém a nano UHPLC systému s použitím gradientu vody a methanolu s 0,1 % kyseliny mravenčí. Paralelní měření se provádělo v lineární iontové pasti pro cílenou kvantifikaci a v Orbitrapu ve vysokém rozlišení pro datově závislou neřízenou analýzu. Fragmentace vzorků byla realizována pomocí HCD, CID a UVPD, což umožnilo charakterizovat izomerické formy.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC (nano flow)
• Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid mass spectrometer
• ACQUITY UPLC BEH Phenyl column, 100×2,1 mm, 1,7 µm
• Thermo Scientific EASY-Spray C18 HPLC column pro nanoLC
• Software FreeStyle, Mass Frontier 8.0, Compound Discoverer 3.4, TraceFinder 5.2

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla detekčních mezí (LOD) v rozsahu 0,2–2 ppb a kvantifikačních mezí (LOQ) 0,5–5 ppb pro sedm klíčových nitrosaminů (NDMA, NMEA, NDEA, NPYR, NPIP, NIPA, NDBA) v extraktech lidské moči. Při nanoLC byla kvantifikace možná až na úrovni jednotek fg (ppt). Lineární závislost signálu na koncentraci vykázala koeficient R2 nad 0,99. Současně byly neznámé nitrosaminy úspěšně identifikovány v režimu discovery analýzy ve vysokém rozlišení.

Přínosy a praktické využití

• Rychlá a komplexní analýza známých i neznámých nitrosaminů v jednom běhu
• Vysoká citlivost umožňující detekci na úrovni ppt–ppb
• Uplatnění v kontrolách kvality léčiv, potravin, vody a biologických vzorků
• Flexibilita využití různých fragmentačních technik pro detailní charakterizaci sloučenin

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zdokonalení nanoLC pro zvýšení citlivosti a rozlišení
• Aplikace strojového učení pro automatizovanou identifikaci neznámých látek
• Rozšíření workflow na jiné třídy stopových kontaminantů
• Integrace s režimy ion mobility pro lepší separaci izomerů

Závěr

Optimalizovaný SQUAD workflow pro Orbitrap IQ-X Tribrid MS nabízí spolehlivou a citlivou metodiku pro paralelní kvantifikaci a objevování nitrosaminů v biologických matricích. Metoda prokázala výborné analytické parametry (LOD, LOQ, linearita) a poskytuje komplexní nástroj pro výzkum, QA/QC i regulaci karcinogenních nečistot.