Simultaneous Quantitation and Discovery (SQUAD) analysis: Combining targeted and untargeted metabolomics on Orbitrap-based mass spectrometers

Význam tématu

Metabolomika je klíčovou součástí moderní biochemie a poskytuje informace o malých molekulách podmiňujících fyziologické a patologické procesy. Tradiční způsoby zahrnují untargeted (objevnou) analýzu, která detekuje co nejvíce metabolitů s omezenou přesností kvantifikace, a targeted (cílenou) analýzu, jež se zaměřuje na předem vybranou skupinu látek s vysokou citlivostí a přesností. Kombinace obou přístupů v rámci jediné analýzy přináší vyvážené řešení a rozšiřuje možnosti výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je představit a demonstrovat nový workflow nazvaný Simultaneous Quantitation and Discovery (SQUAD) analysis, který v rámci jediné injekce vzorku spojuje cílenou kvantifikaci předdefinovaných metabolitů a zároveň umožňuje nedefinované objevné sledování dalších sloučenin. Práce hodnotí přínosy a limity metody na různých Orbitrapových platformách, analyzuje možnosti zvýšení pokrytí metabolomu a diskutuje optimalizaci analytických podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow SQUAD zahrnuje:

• Přípravu vzorků a kalibraci pomocí autentických standardů a izotopově značených interních standardů.
• Plnoskenovací vysoce přesnou hmotnostní detekci (HRAM MS1) pro kvantitativní i objevnou část.
• Rychlou a cílenou MS2 analýzu (DDA nebo PRM/SIM) pro potvrzení identity a fragmentační charakteristiku neznámých látek.
• Inteligentní akviziční rutiny AcquireX pro maximalizaci počtu relevantních MS2 záznamů z QC vzorků.
• Bioinformatické zpracování dat v softwaru Compound Discoverer s podpůrným využitím knihoven mzCloud, KEGG, ChemSpider, NIST.

Hlavní použité hmotnostní spektrometry:

• Orbitrap Exploris (MX, 120, 240) s funkcí rychlého přepínání polarity
• Orbitrap Tribrid (IQ-X, Ascend) kombinující kvadrupól, lineární iontový past a Orbitrap
• Orbitrap Astral pro ultrarychlou a citlivou MS2 detekci při plnoskenovací HRAM MS1

Hlavní výsledky a diskuse

• SQUAD na Orbitrap Exploris zvládá v jediné injekci přesně kvantifikovat modelové aminokyseliny v plazmě s úrovní detekce již od 25 fmol na sloupci a lineárním dynamickým rozsahem 5 řádů velikosti.
• Orbitrap Tribrid poskytuje citlivou kvantifikaci v lineární iontové pasti (LLOQ 0,5 fmol) a současně HRAM rozlišení až 500 000 pro MS1 a MSn fragmentace (HCD, CID, UVPD) umožňující spolehlivou strukturální identifikaci neznámých.
• Orbitrap Astral dokáže zkrátit LC gradient až na 5 minut bez ztráty kvality kvantifikace (LLOQ 10 fmol) a díky vysoké rychlosti MS2 fragmentovat ~90 % detekovaných sloučenin, což vede k významnému zvýšení počtu anotovaných metabolitů.
• Inteligentní akvizice AcquireX rozšiřuje analytické pokrytí tím, že automaticky generuje vylučovací a inkluzní seznamy pro hlubokou DDA analýzu.

Přínosy a praktické využití metody

• Úspora vzorku a času díky jediné injekci místo kombinace dvou metod.
• Možnost retrospektivní analýzy dat pro objev nových biomarkerů či metabolických drah.
• Aplikace v klinickém výzkumu pro objev a validaci biomarkerů v biofluidech.
• Využití v mikrobiálním metabolizmu, farmacobiotice, inženýrství metabolismu a analýze přírodních produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Doplnění standardních knihoven o nové autentické standardy a jejich široká dostupnost.
• Integrace umělé inteligence a strojového učení pro rychlejší a přesnější anotaci spekter.
• Další zrychlování chromatografických metod a masových analyzátorů pro vysokopropustné screeny.
• Rozšíření SQUAD analýzy na další třídy biomolekul a meziprodukty.

Závěr

SQUAD analysis představuje inovativní hybridní workflow, které umožňuje rovnováhu mezi širokou objevnou analýzou a přesnou cílenou kvantifikací v jediném běhu. Implementace na různých Orbitrapových platformách prokázala vysokou citlivost, rozsah dynamické kvantifikace a vynikající schopnost identifikovat nové metabolity, což výrazně zefektivňuje metabolomické studie.

Reference

1. Fiehn O Metabolomics The Link between Genotypes and Phenotypes Plant Mol Biol 2002 48 155–171
2. Chen L Zhong F Zhu J Bridging Targeted and Untargeted Mass Spectrometry Based Metabolomics via Hybrid Approaches Metabolites 2020 10 doi 10 3390 metabo10090348
3. Schrimpe-Rutledge AC Codreanu SG Sherrod SD Mclean JA Untargeted Metabolomics Strategies Challenges and Emerging Directions J Am Soc Mass Spectrom 2016 1897–1905
4. Amer B Baidoo EEK Omics Driven Biotechnology for Industrial Applications Front Bioeng Biotechnol 2021 9 doi 10 3389 fbioe 2021 613307
5. Roberts LD Souza AL Gerszten RE Clish CB Targeted Metabolomics Curr Protoc Mol Biol 2012 98 30 2 1–30 2 24
6. Dudley E Yousef M Wang Y Griffiths WJ Targeted Metabolomics and Mass Spectrometry Advances in Protein Chemistry and Structural Biology Elsevier 2010 45–83
7. Chen S Kong H Lu X Li Y Yin P Zeng Z Xu G Pseudotargeted Metabolomics Method and Its Application in Serum Biomarker Discovery Anal Chem 2013 85 8326–8333
8. Kuhring M Eisenberger A Schmidt V Kränkel N Leistner DM Kirwan J Quality Control in Targeted Metabolomics Anal Chem 2020 92 10241–10245
9. Mazzini FN Cook F Gounarides J Marciano S Haddad L Tamaroff AJ Casciato P Plasma and Stool Metabolomic Biomarkers of Non Alcoholic Fatty Liver Disease in Argentina medRxiv 2020
10. Amer B Deshpande RR Bird SS Simultaneous Quantitation and Discovery Analysis Combining the Best of Targeted and Untargeted Mass Spectrometry Based Metabolomics Metabo 2023 13 5 648–665
11. Alseekh S Aharoni A Brotman Y Contrepois K D’Auria J Ewald J Fraser PD Giavalisco P Hall RD Mass Spectrometry Based Metabolomics A Guide for Annotation Quantification and Best Reporting Practices Nat Methods 2021 18 747–756
12. Lu W Su X Klein MS Lewis IA Fiehn O Rabinowitz JD Metabolite Measurement Pitfalls to Avoid and Practices to Follow Annu Rev Biochem 2017 86 277–304
13. Jourdan F Breitling R Barrett MP Gilbert D MetaNetter Inference and Visualization of High Resolution Metabolomic Networks Bioinformatics 2008 24 143–145