Simultaneous Quantitation and Discovery (SQUAD) metabolomics workflow implementing parallel analysis on Thermo Ascend Tribrid instrument

Význam tématu

Metabolomika představuje klíčový nástroj pro studium malých molekul ve vzorcích biologického původu. Kombinace cílené kvantifikace a neřízeného objevování metabolitů v jednom běhu výrazně zvyšuje efektivitu analýzy, minimalizuje spotřebu vzorku a umožňuje zpětnou analýzu potenciálně významných, původně nezamýšlených sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

• Vyvinout jednorázovou injekční metodu SQUAD (Simultaneous Quantitation and Discovery), která propojí nepřerušenou identifikaci nových metabolitů s přesnou kvantifikací vybraných standardů.
• Otestovat workflow na standardizované plasmatické matrici NIST SRM 1950.
• Porovnat výkonnost lineární iontové pasti a orbitrapu v rámci systému Thermo Scientific™ Ascend™ Tribrid.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: extrakce plasmy NIST SRM 1950 80% methanolem, přídavek izotopově značených aminokyselin a organických kyselin (Sigma, CIL) v rozmezí 1 nM–2,5 mM.
• Separace: reverzní fázová chromatografie na HPLC Hypersil GOLD™.
• Spektrometrie: Thermo Scientific™ Orbitrap Ascend™ Tribrid se dvěma analyzátory – vysokorozlišeným orbitrapem pro MS1 rozšířené skenování a citlivou lineární iontovou pastí pro tMS2 kvantifikaci.
• Data acquisition: paralelní full-scan MS1 v orbitrapu a tMS2 v lineární pasti; optimalizace pomocí AcquireX workflow pro maximální počet relevantních MS/MS spekter.
• Software: TraceFinder™ 5.1 pro kvantifikaci a Compound Discoverer™ 3.3 pro anotaci neznámých sloučenin.

Hlavní výsledky a diskuse

• Senzitivita lineární iontové pasti dosahuje 5 femtomolů (LOQ) a dynamického rozsahu 10⁶ ve vybraných aminokyselinách (např. fenylalanin, leucin, tryptofan).
• Limit detekce (LOD) pro fenylalanin stanoven 0,25 femtomolu na kolonu.
• V porovnání s jinými Tribrid platformami systém Ascend zaznamenal o 55 % více MS1 iontů a o 25 % více MS2 iontů, což vedlo k nárůstu počtu anotovaných neznámých metabolitů o 15 %.
• Orbitrapní MS1 skenování umožnilo rozšířenou možnost zpětné dolování dat a lepší pokrytí metabolitu v širším dynamickém rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorázová analýza spojuje cílenou kvantifikaci a neřízené objevování, odstraňuje potřebu více vstřiků a vícenásobných přístrojů.
• Umožňuje retrospektivní hledání biomarkerů či nových metabolických drah ve stávajících datech.
• Systém Ascend zkracuje dobu analýzy a zvyšuje reprodukovatelnost díky rychlé alternaci mezi MS1 a tMS2 módy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace SQUAD s dalšími „omics“ technologiemi (proteomika, lipidomika) pro komplexní multi-omics přístupy.
• Automatizace datového zpracování s využitím strojového učení pro pokročilou identifikaci neznámých sloučenin.
• Rozšíření workflow na klinické a průmyslové aplikace, např. farmakokinetika, toxikologie, QA/QC potravin.

Závěr

Workflow SQUAD na platformě Thermo Scientific™ Ascend™ Tribrid úspěšně spojuje citlivou kvantifikaci a široké objevování metabolitů v jednom běhu. Díky vysoké senzitivitě lineární iontové pasti a rozšířenému MS1 skenování orbitrapu metoda přináší vyšší produktivitu, úsporu vzorku a možnost detailní retrospektivní analýzy dat.

Reference

• Amer B., Huang J., Bergen D., Deshpande R.R., Zabrouskov V., Bird S.S. Simultaneous Quantitation and Discovery (SQUAD) metabolomics workflow implementing parallel analysis on Thermo Ascend Tribrid instrument. Thermo Fisher Scientific, 2023.