Advancing bile acid quantitation: High-specificity MS2 and MS3 analysis using the Stellar Mass Spectrometer

Význam tématu

Báze žlučových kyselin představují klíčové molekuly pro trávení tuků, vstřebávání vitaminů a signální komunikaci mezi játry a střevní mikrobiotou. Jejich kvantitativní analýza v biologických vzorcích pomáhá sledovat zdravotní stavy, diagnostikovat choroby a zkoumat interakce mikrobiomu s hostitelem. Zvýšený zájem o role žlučových kyselin v onemocněních, jako je autismus nebo gastrointestinální poruchy, vyžaduje metody s vysokou selektivitou a citlivostí pro rozlišení strukturně podobných izomerů.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout jedinou analytickou metodu kombinující cílené MS2 i MS3 skeny na hmotnostním spektrometru Stellar, aby umožnila absolutní kvantifikaci primárních, sekundárních a konjugovaných žlučových kyselin v lidském séru. Metoda byla validována na standardech i referenčním plazmatickém materiálu NIST a následně aplikována na vzorky dětí s poruchou autistického spektra před a po suplementaci vitamíny a minerály.

Použitá metodika a instrumentace

Postup analýzy zahrnoval:

• Příprava vzorků: extrakce plazmy s 0,1 % kyselinou mravenčí v isopropanolu, vysušení a rekonstituce v 50 % methanolu.
• Chromatografie: reverzně-fázová kolona, Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC, doba analýzy 9 minut.
• Hmotnostní spektrometrie: Stellar mass spectrometer se scan módy tMS2 a tMS3, aktivace HCD i CID.
• Software: mzVault pro generaci přechodů, Skyline pro vývoj metody, Chromeleon CDS 7.3.2 pro akvizici a zpracování dat, TraceFinder 5.2 pro doplňkovou analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky na rozsahu 0,2–1000 nM vykázaly lineárnost (r>0,99) pro většinu žlučových kyselin. Metoda dosáhla LOQ od 0,2 do 10 nM (CV < 20 %). Dynamický rozsah pokrývá pět řádů velikosti a selektivita MS3 fragmentace umožnila rozlišení blízkých izomerů, např. GCDCA a GDCA. Aplikace na vzorcích 49 dětí (17 typicky vyvíjejících se, 16 s ASD, 16 s ASD+VM) ukázala koncentrace celkových žlučových kyselin 5–2100 nM. Po suplementaci vitamíny a minerály u 11 z 16 dětí s ASD došlo k poklesu > 30 % v celkové abundanci, což koreluje s poklesem primárních a konjugovaných kyselin.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou citlivost a selektivitu pro cílenou kvantifikaci více než 40 analyzovaných látek v jednom běhu.
• Rychlou analýzu s krátkou chromatografickou dobou a stabilní opakovatelnost (RSD < 10 % pro většinu sloučenin).
• Možnost sledovat biologické změny žlučových kyselin v klinických studiích a v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k:

• Automatizaci přípravy vzorků a integraci s robotickými platformami.
• Rozšíření spektra analyzovaných metabolit mikrobiomu spojených se žlučovými kyselinami.
• Využití vysokého rozlišení MS3 pro objevování nových biomarkerů v gastrointestinálních a neurologických onemocněních.

Závěr

Kombinovaný tMS2/tMS3 přístup na Stellar hmotnostním spektrometru se osvědčil jako robustní a univerzální metoda pro detailní kvantifikaci žlučových kyselin. Díky vynikající citlivosti, selektivitě a širokému dynamickému rozsahu je vhodná pro klinické i výzkumné aplikace zaměřené na mikrobiom, trávení a diagnostiku chorob.

Reference

1. Remes P. M. et al. Hybrid Quadrupole Mass Filter–Radial Ejection Linear Ion Trap and Intelligent Data Acquisition Enable Highly Multiplex Targeted Proteomics, J. Proteome Res. 2024, 5476.