Exploring Different HPLC Column Chemistries for Optimal Separation of 17 Bile Acids by LC-MS/MS

Význam tématu

Analýza žlučových kyselin v lidské plasmě představuje klíčový nástroj pro diagnostiku onemocnění jater a sledování možných nežádoucích účinků léčiv. Vysoká chemická rozmanitost, přítomnost isomerů a matrixové interference vyžadují optimalizaci separační metody pro spolehlivou kvantifikaci.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na srovnání čtyř fází HPLC kolony (C18, Biphenyl, FluoroPhenyl, ARC-18) pro separaci 17 žlučových kyselin v režimu LC-MS/MS. Hlavním požadavkem bylo úplné rozlišení isomerních párů a eliminace interference s interním standardem UDCA-D4.

Použitá instrumentace

• LC-MS/MS s elektrosprejovou ionizací v negativním režimu
• HPLC kolony Restek Raptor:
  • C18 50×2,1 mm, 1,8 µm
  • Biphenyl 100×2,1 mm, 2,7 µm
  • FluoroPhenyl 100×2,1 mm, 2,7 µm
  • Inert ARC-18 100×2,1 mm, 2,7 µm
• Mobilní fáze A: 5 mM acetát amonný ve vodě
• Mobilní fáze B: 50:50 methanol a acetonitril
• Teplota kolony 50–60 °C, injekční objem 3–5 µl

Metodika

Pro každou kolonou byl aplikován scouting gradient od 10 do 100 procent fáze B v čase 8 minut s následným návratem do výchozího stavu. Bylo sledováno eluce jednotlivých kyselin, rozlišení isomerů i případné interference. Po vyhodnocení screeningových dat proběhlo doladění gradientu a průtoku, včetně krátkodobého zvýšení toku pro odstranění lipidových matricových složek.

Hlavní výsledky a diskuse

• C18 kolona zajistila úplné rozdělení všech analyzovaných kyselin, avšak vzorky vykazovaly interferenci s interním standardem UDCA-D4
• Biphenylová fáze eliminovala interferenci částečně, ale nedostatečně rozlišila isomery CDCA a DCA
• FluoroPhenyl kolona odstranila interferenci, nicméně tři isomerní páry (GCDCA/GDCA, TCDCA/TDCA, CDCA/DCA) se částečně srážely
• Inertní ARC-18 kolona nabídla optimální selektivitu pro všechny 17 kyselin i interní standard, přičemž zvýšení průtoku na 0,8 ml/min umožnilo efektivní flush lipidů

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou kvantifikaci žlučových kyselin v biologických maticích s vysokou selektivitou a reprodukovatelností. Výsledná analýza podporuje klinickou diagnostiku jaterních onemocnění i hodnocení bezpečnosti nových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových stacionárních fází se zlepšenou selektivitou izomerů
• Integrace ultrarychlých technik UHPLC pro zkrácení doby analýzy
• Použití vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie v metabolomických studiích
• Automatizace přípravy vzorků a aplikace umělé inteligence pro optimalizaci metod

Závěr

Nejvhodnějším prostředím pro separaci 17 žlučových kyselin byla inertní ARC-18 kolona, která zajistila plné rozlišení isomerů a eliminaci matrixových interferencí. Zvýšení průtoku v klíčové části gradientu vedlo k efektivnímu proplachu nežádoucích lipidových složek.

Reference

• Berkland H, Gairloch E Exploring Different HPLC Column Chemistries for Optimal Separation of 17 Bile Acids by LC-MS/MS Restek Corporation Bellefonte PA