Sensitive and selective quantitation of bile acids using targeted MS2/MS3 on the Stellar mass spectrometer

Význam tématu

Žlučové kyseliny hrají klíčovou roli v emulgaci a vstřebávání tuků, zatímco mikrobiálně modifikované konjugáty odrážejí stav střevní mikrobioty a metabolického zdraví. Nízké hladiny v krvi komplikují jejich analýzu, což vyžaduje vysoce citlivé a selektivní metody pro klinické i výzkumné aplikace.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo ověřit schopnost hmotnostního spektrometru Stellar MS využívajícího cílené tMS2/tMS3 skenování pro kvantifikaci 16 žlučových kyselin a konjugátů v lidském séru. Studie zahrnovala optimalizaci fragmentačních režimů, stanovení mezí kvantifikace (LOQ) a validaci na vzorcích dětí s autismem před a po podání vitaminově-minerálního doplňku.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: UHPLC Vanquish Horizon, Waters Acquity BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 µm), 9min gradient methanol–voda s kyselinou mravenčí, průtok 0,3 mL/min, teplota 50 °C.
• Spektrometrie: Hybridní kvadrupól–dvojitý lineární iontový past Stellar MS, operační režimy tMS2 (CID/HCD) a tMS3 s na míru optimalizovanými kolizními energiemi pro každou kyselinu.
• Příprava vzorků: Extrakce na Phree pla­tech, 1% kyselina mravenčí v acetonitrilu, sušení, rekonstituce ve 400 nM interním standardu, injekce 2 µL.
• Software: Xcalibur 4.7 pro akvizici, TraceFinder 5.2 pro kvantifikaci, využití mzCloud databází pro optimalizaci fragmentace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Fragmen­tační režimy: Konjugáty preferovaly HCD pro lepší poměry iontů, zatímco volné kyseliny mohly využít CID.
• Snížení šumu: Víceúrovňová fragmentace tMS3 u cholicové kyseliny výrazně zlepšila poměr signál/šum a posunula LOQ o dva kroky dolů.
• Dynamický rozsah: Lineární detekce v rozsahu <1 nM až 1000 nM (4 řády). DCA vykázala R2 = 0,9989 až 0,5 nM.
• Reproducibilita: LOQ na kolonu 0,38–2,00 pg (u volných a konjugovaných kyselin), %RSD interních standardů <15 %, většina <8 %.
• Aplikace na sérové vzorky: U 11 ze 16 dětí s ASD se po suplementaci prokázalo >30 % snížení celkové hladiny žlučových kyselin, shodné se změnami v primárních a konjugovaných frakcích.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoce citlivá a selektivní kvantifikace žlučových kyselin usnadňuje studi­um dysbiozy, biomarkerů jaterních a střevních onemocnění a monitorování účinků výživových intervencí. Metoda je vhodná pro klinické laboratoře, farmaceutický výzkum i environmentální testování biologických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření analytického panelu o nově objevené konjugáty a meziprodukty mikrobiálního metabolismu.
• Integrace s vysokoproko­derním metabolomickým workflow a bioinformatikou pro komplexní profiling střevní mikrobioty.
• Real-time monitoring metabolických změn v klinických studiích a personalizované medicíně.

Závěr

Cílená tMS2/tMS3 akvizice na Stellar MS umožnila odhalit a kvantifikovat široké spektrum žlučových kyselin v dávkách pod 1 nM s vynikající selektivitou a opakovatelností. Metoda prokázala svůj přínos při hodnocení biochemických změn u dětí s ASD a je perspektivní pro další klinické i výzkumné aplikace.

Reference

1. Remes P. M., et al. J. Proteome Res. 2024, 5476.