Sensitive Quantitation of Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) Analog Semaglutide from Plasma

Význam tématu

Glukagon-like peptid-1 (GLP-1) analogické léky, zejména semaglutid, představují klíčové nástroje v terapii obezity a diabetu 2. typu. Precizní měření plazmatických koncentrací je zásadní pro charakterizaci farmakokinetiky a toxikokinetiky, podpoření vývoje a schvalování těchto léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout a ověřit plně automatizovaný LC/MS workflow pro citlivou a specifickou kvantifikaci semaglutidu v lidské plazmě. Nové řešení mělo překonat tradiční organickou precipitaci co do citlivosti, rozsahu lineárnosti a reproducibility, přičemž by eliminovalo potřebu specifických protilátek.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika přípravy vzorku zahrnovala dvoustupňovou extrakci: proteinovou precipitaci směsí ACN:MeOH (1:1) a následné čištění s využitím Agilent AssayMAP RP-S kazet.
Reagencia a vzorky:

• Semaglutid a tirzepatid (interní standard) v lidské plazmě
• Formic acid, amonium formát, acetonitril, methanol

Instrumentace:

• Agilent AssayMAP Bravo (platforma pro proteomickou přípravu vzorků)
• Agilent 1290 Infinity II bio LC (vysokorychlostní pumpa, multisampler, teplotní blok s výměníkem)
• Agilent 6495D triple quadrupole LC/TQ s Jet Stream ESI
• Chromatografická kolona AdvanceBio Peptide Mapping 2.1×150 mm, 120 Å, 2.7 μm
• Software MassHunter Acquisition a Quantitative Analysis verze 12.0

Klíčové LC parametry: mobilní fáze A (voda + 0.1 % FA), B (ACN + 0.1 % FA), gradient 30–95 % B v 10 min, průtok 0.4 mL/min, 80 °C. MS parametry: pozitivní ESI, MRM přechody semaglutidu 1 029.4→1 238.1 (kvant.), 1 029.4→136.1 (kvalif.), tirzepatid 1 204.4→396.2; teplota zdroje 270 °C, plyn 13 L/min, tryska 400 V, kapilára 5 500 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace precipitace ukázala, že směs ACN:MeOH 1:1 poskytuje nejvyšší výtěžek GLP-1 peptidů. Pro čistění na RP-S kazetách byla jako nabíjecí pufr použita čistá voda, pro wash 10 % ACN v 10 mM NH4COOH pH 10 a pro eluci 5 % FA v 80 % ACN. Tento postup zvýšil citlivost assay pětinásobně oproti klasické precipitaci. Metoda dosáhla dolní meze kvantifikace (LLOQ) 0.2 ng/mL a lineární rozsah až 1 000 ng/mL (3,7 řádová dynamika), s korelačním koeficientem R2 = 0.9946. Intra- i interdenní přesnost a správnost QC vzorků splnily regulační kritéria ±15 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a specifita kvantifikace GLP-1 analogů
• Plná automatizace minimalizuje manuální chyby a zkracuje čas přípravy
• Žádná nutnost specifických protilátek – univerzální aplikace
• Široký lineární rozsah umožňuje analýzu nízkých i vysokých koncentrací

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace workflow pro další peptidové a proteinové léky
• Integrace s high-throughput screeningem v PK/TK studiích
• Využití nových sorbentů a nanomateriálů pro zlepšení citlivosti
• Implementace v klinických laboratořích a kontraktních vývojových organizacích

Závěr

Navržený automatizovaný workflow LC–MS pro semaglutid v lidské plazmě prokázal vynikající citlivost, specifitu a reprodukovatelnost s LLOQ 0.2 ng/mL a lineárním rozsahem až 1 000 ng/mL. Díky eliminaci specifických protilátek a rychlé metodické optimalizaci je tento přístup vhodný pro podporu vývoje GLP-1 terapie.

Reference

1. Ozempic – semaglutide injection, DailyMed, 5. 6. 2021
2. Rybelsus – oral semaglutide tablet, DailyMed, 5. 6. 2021
3. Wegovy – semaglutide injection, DailyMed, 14. 12. 2021