Comprehensive workflow for Automated Sample Cleanup and Sensitive Quantitation of Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) Analogs from Plasma

Význam tématu

V posledních letech získaly GLP-1 receptoroví agonisté, zejména semaglutid, zásadní význam v terapii obezity a diabetu 2. typu. Pro sledování farmakokinetiky a vyhodnocení účinnosti těchto peptidů je nezbytné vyvinout velmi citlivé a reprodukovatelné analytické metody. Kombinace automatizovaného čištění vzorku a hmotnostní spektrometrie nabízí rychlou a spolehlivou kvantifikaci s minimálním ručním zásahem.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo vytvořit plně automatizovaný workflow pro extrakci semaglutidu z lidské plazmy pomocí modulu AssayMAP a následnou kvantifikaci LC-MS/MS metodou. Studie hodnotí:

• Optimalizaci srážení bílkovin organickými rozpouštědly.
• Podmínky nanášení, promývání a elučních pufrů na RP-S kazetách.
• Srovnání citlivosti proti klasickému protein crashu.
• Lineární rozsah a kvalitu kalibrační křivky a kontrolních vzorků.

Použitá instrumentace

• Automatizační platforma AssayMAP Bravo.
• UHPLC systém Agilent 1290 Infinity II Bio LC.
• Hmotnostní spektrometr Agilent 6495D triplový kvadrupól.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy (100 µL) byly obohaceny semaglutidem a interním standardem tirzepatidem. Proteiny se precipitovaly směsí ACN : MeOH (1:1), poté se supernatant zasušil a znovu redissolvoval ve vodě. Čištění probíhalo na RP-S kazetách:

• Kondice: 80% ACN, equilibrace vodou.
• Nanášení vzorku: 100 µL při 3 µL/min.
• Promývání: voda a 10% ACN v 10 mM NH4COOH (pH 10).
• Eluce: 5% FA v 80% ACN.

Separační podmínky UHPLC:

• Kolona AdvanceBio Peptide Mapping (2,1 × 150 mm, 2,7 µm, 120 Å), 80 °C.
• Mobile phase A: voda + 0,1% FA, B: ACN + 0,1% FA, tok 0,5 mL/min.
• Gradient 30–95% B během 8 min.

MS/MS parametry:

• MRM tranziční pár 1029,4→1238,1 pro semaglutid, 1204,4→396,2 pro tirzepatid.
• Teplota plynu 270 °C, kapilární napětí 5500 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizované čištění pomocí AssayMAP RP-S zlepšilo citlivost metody pětinásobně oproti klasickému protein crashu. LLOQ dosahuje 0,2 ng/mL s lineárním rozsahem 0,2–1000 ng/mL (R2 > 0,994). Intra- i interdenní přesnost a správnost QC vzorků splňují regulační kritéria (bias < 15%, CV < 15%). Optimalizace organické fáze, načítacího, promývacího a elučního pufru byla klíčová pro maximální zotavení a selektivitu GLP-1 peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší následující výhody:

• Vyšší citlivost a nízký objem vzorku (100 µL).
• Automatizace zkracuje dobu analýzy a minimalizuje pracovní zatížení.
• Robustní reprodukovatelnost vhodná pro PK/PD studie a QA/QC laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k multiplexní analýze více peptidů současně, integraci on-line vzorkového předzpracování nebo využití vysokého rozlišení MS pro strukturuální charakterizaci analogů. Pokračující automatizace a miniaturizace umožní ještě vyšší propustnost a nižší spotřebu vzorku.

Závěr

Vyvinutý workflow kombinuje automatizované čištění vzorků a vysoce citlivou LC-MS/MS analýzu semaglutidu v lidské plazmě. Metoda dosahuje nízké hranice kvantifikace, širokého lineárního rozsahu a vynikajících statistik přesnosti a správnosti, což potvrzuje její vhodnost pro farmakokinetické studie a klinické aplikace.

Reference

• Ozempic – semaglutide injection, solution. DailyMed. 5 June 2021.
• Rybelsus – oral semaglutide tablet. DailyMed. 5 June 2021.
• Wegovy – semaglutide injection, solution. 14 Dec. 2021.