An Easy-to-Execute Direct-Connect 2D Protein A–SEC Method for the Analysis of Monoclonal Antibody Titer and Size Variants in Cell Culture

Význam tématu

Monoklonální protilátky jsou klíčové v biotechnologii a farmaceutickém vývoji. Zajištění přesného stanovení titru a kvality (velikostní varianty) v kultivačních médiích je zásadní pro kontrolu výroby, bezpečnost produktu a účinnost léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je představit jednoduchou dvoudimenzionální metodu ProA-SEC umožňující současné stanovení titru mAb a kvantifikaci fragmentů s odlišnou molekulovou hmotností (HMWS, LMWS) bez složitých přepínacích ventilů nebo druhé pumpy.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda je založena na přímém sériovém zapojení kolony Protein A (2.1×20 mm, 3.5 µm) a SEC kolony (4.6×150 mm, 1.7 µm) na jednom UHPLC systému.
Analýza probíhá ve dvou krocích:

• naložení vzorku na ProA kolonu, zachycení mAb a variant s ProA afinitou;
• po průchodu nevyvázaných komponent injekce 10 µL kyseliny citronové pH 2 k elučnímu uvolnění vázaných protilátek a separace na SEC.

Instrumentace:

• UHPLC systém ACQUITY Premier QSM s TUV detektorem 280 nm
• BioResolve Protein A Affinity Column, MaxPeak Premier, 3.5 µm, 2.1×20 mm
• ACQUITY Premier Protein SEC Column, 250 Å, 1.7 µm, 4.6×150 mm
• Empower CDS pro správu dat

Podmínky: 0.30 mL/min, kolony při okolní teplotě, vzorek při 6 °C, analýza 15 minut.

Hlavní výsledky a diskuse

• Obnova titru: 98.6 % pro NISTmAb, 97.8 % pro trastuzumab.
• Linearity v rozsahu 1–10 µg s maximálními reziduály do 3.3 %.
• HMWS: u NISTmAb nižší relativní množství oproti SEC, u trastuzumabu vyšší (indikace metody indukovaných agregátů).
• LMWS1 detekována u obou mAb, LMWS2 (Fab) pouze u trastuzumabu kvůli dodatečné ProA afinitě.
• Standardní adice v kultivačním médiu prokázaly lineární odezvu a minimalizovaný bias (korelace 1.04 pro NISTmAb, 0.94 pro trastuzumab).

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduché provedení na jednom UHPLC systému bez přepínacích ventilů.
• Rychlá a spolehlivá analýza titru a srovnávací hodnocení velikostních variant.
• Možnost sledovat LMWS s ProA afinitou, vhodné pro bi-specifické a fusion proteiny.
• Analýza v kultivačních médiích s minimální přípravou vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace recovery a snížení indukce agregátů pro specifické mAb konstrukty.
• Rozšíření na multispecifické protilátky, fusion proteiny a nové formáty biologik.
• Integrace s online monitorovacími platformami pro průběžnou kontrolu výroby.
• Vylepšení inertních povrchů v kolónách pro minimalizaci interakcí.

Závěr

Představená metoda přináší robustní a časově úsporné řešení pro simultánní stanovení titru mAb a velikostních variant v kultivačních médiích. Jednoduchá instrumentace a vysoká opakovatelnost podporují její využití v procesu vývoje a kontroly kvality monoklonálních protilátek.

Reference

• Lemmerer et al. J Immunol Methods, 2013.
• Gjoka et al. J Chromatogr B, 2014.
• Dunn et al. MAbs, 2020.
• Lavelay Kizekai et al. Waters Application Note, 2022.