TMT Workflow on the Q Exactive Series - Instrument Parameter Optimization and Data Analysis in Proteome Discoverer 2.1 Software

Význam tématu

Isobarické značení pomocí TMT sixplex a tenplex umožňuje současnou relativní kvantifikaci až deseti vzorků v jednom běhu LC-MS/MS. Tato metoda výrazně zkracuje dobu analýzy, snižuje experimentální variabilitu a minimalizuje chybějící hodnoty, což je zásadní pro vysoce kvantitativní proteomické studie v biomedicíně, farmaceutickém výzkumu a průmyslové analytice.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a optimalizovat akviziční metodu pro relativní kvantifikaci proteinů s využitím workflow TMTsixplex a TMT10plex na platformách Q Exactive Plus a Q Exactive HF. Studie zahrnuje popis přípravy vzorku, chromatografického dělení, nastavení hmotnostního spektrometru a následného zpracování dat v Proteome Discoverer 2.1.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: Standardní digesty Escherichia coli a lidské HeLa buňky značené TMT reagenty (kanály sixplex 126–131 a tenplex vybrané kanály).
• Chromatografie: Thermo Scientific EASY-nLC 1000, akcesní kolony PepMap 100 C18 (75 μm × 2 cm) a separační EASY-Spray C18 (75 μm × 50 cm, 2 μm, 100 Å); gradient 7–25 % B/100 min, 25–60 % B/20 min, tok 300 nL/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Q Exactive Plus (MS1 70 000 FWHM @ m/z 200; MS2 30 000–60 000) a Q Exactive HF (MS1 120 000; MS2 30 000–60 000); AGC target 3e6 pro MS1 a 1e5 pro MS2; maximální injekční časy 50–100 ms; izolace 0,7–1,2 Th; kolizní energie NCE 32.
• Software: Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.1 s workflow SequestHT a Reporter Ion Quantifier, korekcí izotopových distribucí a normalizací na sumu S/N hodnot.

Hlavní výsledky a diskuse

Prodloužení chromatografického gradientu z 2 na 4 hodiny a zvýšení dávky vzorku zlepšilo počet identifikovaných i kvantifikovaných peptidů a proteinů. Zvýšení MS2 injekčního času na 100 ms a AGC targetu na 1e5 vedlo k vyšší citlivosti a přesnosti kvantifikace. Pro TMTsixplex je dostačující rozlišení MS2 30 000, zatímco pro TMT10plex je nutné zvýšení na 35 000–60 000, aby se rozlišily izotopové špičky o rozdílu jen 6 mDa. Užší izolace (0,7 Th) minimalizuje ko-izolaci interferujících iontů, což se projevuje lepší kvantitativní přesností.

Přínosy a praktické využití metody

TMT workflow na přístrojích Q Exactive Plus a HF poskytuje vysokou propustnost a spolehlivou relativní kvantifikaci vzorků buněčných lyzátů či tkání. Metoda je vhodná pro srovnání biologických stavů, časových řad či podmínek léčby, a to v základním výzkumu, klinických studiích i QA/QC aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Pro komplexní vzorky se očekává širší nasazení SPS MS3 metod na tribridních Orbitrap systémech pro dosažení vyšší dynamické škály. Pre-frakceční techniky (např. high pH RP) dále zlepší rozlišení a citlivost. Nové izotopové sady a rychlejší analyzátory Orbitrap zvýší multiplexní kapacitu a kvantitativní přesnost.

Závěr

Komplexní optimalizace chromatografie, parametrů MS1 a MS2 a zpracování dat v PD 2.1 zajistila robustní workflow pro relativní kvantifikaci pomocí TMTsixplex a TMT10plex na Q Exactive platformách. Klíčová je volba správného rozlišení, injekčního času, AGC targetu, izolace a kolizní energie pro maximalizaci počtu identifikací a kvality kvantifikace.

Reference

• Schäfer T. et al. Anal. Chem. 2003, 75(8):1895.
• Ross P. et al. Mol. Cell Proteomics 2004, 3(12):1154.
• Savitski M. et al. Science 2014, 346(6205):1255784.
• Weekes M. et al. Cell 2014, 157(6):1460.
• Rauniyar N. et al. J. Proteome Res. 2014, 13(12):5293.
• Christoforou A. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2012, 404(4):1029.
• Erickson B. et al. Anal. Chem. 2015, 87(2):1241.
• Ting L. et al. Nat. Methods 2011, 8:937.
• Scheltema R. et al. Mol. Cell Proteomics 2014, 13(12):3698.
• McAlister G. et al. Anal. Chem. 2012, 84(17):7469.
• Werner T. et al. Anal. Chem. 2014, 86(7):3594.
• Viner R. et al. Thermo Fisher Scientific Appl. Note 566.
• Arrey T. et al. Thermo Scientific Poster Note 64412.
• Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.1 User Guide.