A Streamlined Workflow for the Characterisation and Relative Quantification of Recombinant Adeno-Associated Viruses using Charge Detection Mass Spectrometry

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) představují klíčové nosiče pro genovou terapii díky schopnosti doručit terapeutický gen do cílových buněk. Přesné stanovení poměru prázdných, částečných, plně naložených a nadměrně naložených kapsid je zásadní pro zajištění účinnosti, bezpečnosti a konzistence klinických a komerčních přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Představen je zjednodušený pracovní postup pro charakterizaci a relativní kvantifikaci rAAV pomocí CDMS v kombinaci se softwarem waters_connect. Studie porovnává výsledky CDMS se třemi ortogonálními metodami: masová fotometrie (MP), multiúhlové rozptylování světla (SEC-MALS) a analytická ultracentrifugace (AUC).

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu byly použity následující přístroje a postupy:

• Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS) na bázi elektrostatického lineárního iontového pasti (ELIT)
• Software waters_connect s knihovnou AAV Analysis Workflow pro definici cílů (Empty, Intermediate, Full, Full(+)) a relativní kvantifikaci iontů podle počtu
• Analytické metody pro srovnání: masová fotometrie (MP), SEC-MALS a analytická ultracentrifugace (AUC)
• Příprava vzorků v roztoku octanu amonného s 0,01 % Pluronic F-68 a nanoelektrospraye

Hlavní výsledky a diskuse

CDMS umožnil přímé měření hmotnosti jednotlivých iontů a rozlišení čtyř hlavních populací kapsid:

• Prázdné kapsidy
• Částečné kapsidy (truncated/contaminant)
• Plně naložené (full) kapsidy
• Nadměrné (overfull) kapsidy

Porovnání kvantifikace mezi metodami pro standardy AAV8 ukazuje shodu v podílu plných kapsid v rozpětí 95–98 % (CDMS 98 %, SEC-MALS 95 %, MP 98 %, AUC 88 %), přičemž součet všech tří kategorií (Empty, Intermediate, Full(+)) se u CDMS, SEC-MALS a MP lišil o méně než 1 %. CDMS navíc prokázal vyšší citlivost k impuritám jako jsou meziprodukty a nadměrné kapsidy.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a ucelená analýza všech populací rAAV v jedné injekci
• Možnost definovat cíle pro libovolné analyty, nejen pro AAV
• Vysoká přesnost relativní kvantifikace v kontextu vývoje procesů a kontroly kvality

Budoucí trendy a možnosti využití

CDMS se díky vícedimenzionálním datům a modulárnímu softwaru očekává uplatnění v:

• Dalším zpřesnění kontroly kvality biologických léčiv
• Vyhodnocování strukturálních heterogenit glykoproteinů a viriontů
• Integraci s online procesní analytickou technologií (PAT) pro kontinuální výrobu

Závěr

Vyvinutý pracovní postup s CDMS a aplikací waters_connect poskytuje výkonný nástroj pro rychlou a přesnou charakterizaci rAAV populací. Metoda je snadno rozšířitelná na další typy biologických makromolekul a podporuje optimalizaci výroby a kontroly kvality.