Characterizing Nucleic Acid Payloads in Lipid Nanoparticles and Viral Vectors via Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS)

Význam tématu

Charakterizace nukleových kyselin v systémech pro doručení terapeutik (lipidové nanočástice – LNP a adeno-asociované viry – AAV) je klíčová pro zajištění kvality, integrity a biologické účinnosti produktů. Velké RNA a DNA molekuly jsou analyticky náročné kvůli vysoké molekulové hmotnosti, polydispersitě a náchylnosti k degradaci. Přímé určování hmotnosti a náboje jednotlivých částic pomocí Charge Detection Mass Spectrometry (CDMS) překonává omezení klasických ensemble metod a umožňuje vysoce rozlišené, kvantitativní posouzení obsahu a heterogenity.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ukázat jednotný pracovní postup CDMS vhodný pro přímé měření jak intaktních dodacích vozidel (AAV, LNP), tak izolovaných nukleových kyselin z těchto formulací. Studie demonstruje schopnost CDMS:

• rozeznat a kvantifikovat populace AAV kapsid (prázdné, částečně naplněné, plné, přepakované) na úrovni jednotlivých částic,
• determinovat intaktní hmotnosti izolovaných genomů z AAV a mRNA z LNP,
• identifikovat plnohodnotné sekvence, zkrácené formy a vedlejší impurity v reprodukovatelných hmotnostních intervalech.

Použitá metodika a instrumentace

Pro AAV:

• Digesce referenčních AAV8 Full kapsidů: 56 °C, 40 min, 1000 rpm v termomixeru.
• Izolace genomického payloadu: Monarch Spin PCR & DNA Cleanup kit (New England Biolabs).
• Výmena pufru: Micro Bio-Spin P6 gel columns (Bio-Rad) do 20 mM amonného acetátu před CDMS.

Pro LNP:

• Deformulace: ředění do 60 mM amonného acetátu v 100 % IPA a vortex 30 s pro uvolnění nukleové kyseliny a rozptýlení lipidových komponent.
• Intaktní vzorky: výměna pufru Bio-Spin P6 (AAV) nebo dialýza Slide-A-Lyzer MINI (Thermo) při 4 °C minimálně 30 min.

Společné analytické kroky:

• Ionizace: nano-elektrospray.
• Instrumentace: benchtop Xevo CDMS (Waters) pro současné měření hmotnosti a náboje na úrovni jednotlivých iontů/částic.
• Software: zpracování dat a kvantitativní analýzy pomocí CDMS Toolkit v rámci waters_connect.

Hlavní výsledky a diskuse

AAV kapsidy:

• CDMS rozlišil populace kapsid v referenčním AAV8 Full standardu a umožnil kvantitativní určení zastoupení: prázdné ≈ 4 %, částečně naplněné ≈ 16 %, plné ≈ 77 %, přepakované ≈ 3 %.
• Po extrakci genomů z AAV byla měřitelná intaktní genomická DNA spolu se zkrácenými a vedlejšími fragmenty; hmotnostní centrum pozic odpovídalo očekávaným hodnotám s malými odchylkami (příklady: ssDNA ~0,87 MDa očekávaně vs. 0,96 MDa naměřeno; dsDNA ~1,86 MDa oček. vs. 1,93 MDa naměřeno).

LNP a mRNA payload:

• Intaktní LNP vykazovaly široké rozložení hmotností, reflektující heterogenní zatížení payloadem a variabilní složení nosiče.
• K izolovanému mRNA payloadu (příklad Spikevax) CDMS detekoval hlavní těžiště kolem ~1,46 MDa, odpovídající přibližně 4101 nukleotidům bez polyA, zároveň byly pozorovány nižší-hmotnostní impurity pocházející jak z nukleových kyselin (trunkáty, degradační produkty), tak ze zbytkových lipidových fragmentů po deformulaci.

Analytická poznámka:

• Dvouvrstvý přístup (intaktní částice i izolované payloady) umožnil korelaci mezi profilem kapsid/LNP a integritou uvolněného nukleového materiálu, což napomáhá identifikovat příčiny neúplného zatížení nebo degradace.

Přínosy a praktické využití metody

CDMS přináší několik praktických výhod pro vývoj a kontrolu kvalit LNP/AAV produktů:

• Přímé měření hmotnosti a náboje na úrovni jednotlivých částic umožňuje kvantifikovat procento plně nabitých vektorem (packaging efficiency) bez potřeby nepřímých odhadů.
• Detekce plnohodnotných a zkrácených nukleových kyselin vede k lepšímu sledování integrity genomu nebo mRNA během výroby a skladování.
• Možnost současného monitorování lipidových či proteinových impurit v deformulovaných vzorcích pomáhá optimalizovat postupy odstranění nosiče a zlepšit čistotu payloadu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Autoři navrhují několik směrů dalšího rozvoje a aplikací CDMS:

• Identifikace nízkomolekulárních a off-target specie pozorovaných CDMS: doplňující analýzy (sekvenování, enzymatické štěpení, elektroforéza) k určení původu truncátů a degradačních produktů.
• Ortogonální potvrzení: integrace CDMS výsledků s klasickými metodami (NGS, capillary electrophoresis, enzymatické testy) pro robustní validaci při regulaci a vývoji.
• Korelativní analýza intaktních částic a izolovaných payloadů pro mapování degradace, mechanismů balení a optimalizaci formulací LNP/AAV.
• Rozšíření platformy CDMS pro vyšší průchodnost, automatizaci a vyšší rozlišení v oblasti nízkomolekulárních nečistot.

Závěr

Studie demonstruje, že CDMS je univerzální a robustní platforma pro charakterizaci nukleových kyselin jak v rámci intaktních LNP a AAV, tak po jejich izolaci. Metoda poskytuje jedinečné informace o délce payloadu, heterogenitě a obsahu impurit na úrovni jednotlivých částic, což významně doplňuje tradiční analytické techniky a podporuje vývoj a kontrolu kvality nových nukleových terapeutik.

Reference

1. Keifer DZ, Pierson EE, Jarrold MF. Charge detection mass spectrometry: weighing heavily charged ions. Anal Chem. 2017;89:826–833.
2. Wörner TP, Snijder J, Bennett A, et al. Resolving heterogeneous macromolecular assemblies by charge detection mass spectrometry. Nat Methods. 2020;17:395–398.
3. Hartmann MD, et al. Characterization of adeno-associated virus capsids by charge detection mass spectrometry. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021;21:231–239.
4. Kulkarni JA, Cullis PR, van der Meel R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: from concepts to clinical utility. Nat Nanotechnology. 2018;13:112–121.