Peptide Mapping of Ovalbumin Using Reversed- Phase High-Performance Liquid Chromatography and Prediction of Phosphopeptide Elution

Význam tématu

Proteiny podléhají posttranslačním modifikacím, které mohou ovlivnit jejich funkci, stabilitu a kvalitu biotechnologických produktů. Peptidové mapování je spolehlivá metoda pro identifikaci a kvantifikaci těchto modifikací, zejména fosforylace. Jako modelový protein se používá ovalbumin s dvěma známými místy fosforylace (S69, S345).

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a otestovat reverzně-fázovou HPLC metodu na analytickém sloupci Acclaim 300 C18 pro separaci tryptických peptidů ovalbuminu a detekci fosfopeptidů. Metoda zahrnovala srovnání peptidových map před a po ošetření alkalickou fosfatázou.

Použitá metodika a instrumentace

Postup sestával z následujících kroků:

• Redukce disulfidických můstků pomocí DTT
• Alkylace cysteinů jodoacetamidem
• Trypsinová digesce rozpuštěných proteinů
• Dialýza a vysušení vzorků (SpeedVac)
• Chromatografie na Dionex UltiMate 3000 s Acclaim 300 C18 (2,1×150 mm, 3 μm) při 50 °C
• Gradient 5–80 % acetonitrilu s 0,1 % TFA, průtok 0,2 mL/min
• Detekce UV při 214 nm (kvalita a opakovatelnost) a při 260 nm (identifikace fosfopeptidů obsahujících fenylalanin)

Hlavní výsledky a diskuse

Systémová kvalifikace s tryptickým digestem cytochromu C prokázala retence RSD ≤ 0,3 % a plocha píků RSD ≤ 1,2 %. Fetuin používaný jako kontrola trypsinové digesce vykázal konzistentních 36 píků s RSD ploch ≤ 3,5 %. Peptidová mapa ovalbuminu obsahovala 35 píků, oproti teoretickým 34 peptidům, což odpovídá přítomnosti fosfo- a de­fosfo-variant.
Ošetření alkalickou fosfatázou vedlo ke zmizení nebo posunu dvou píků (píky 11 a 15), které byly označeny jako EVVGSAEAGVDAASVSEFFR a LPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLR. Srovnání signálu při 260 nm potvrdilo pořadí elučních časů na základě rozdílného obsahu aromatických zbytků.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda nabízí rychlou a reprodukovatelnou kontrolu primární struktury a posttranslačních modifikací proteinů v biotechnologické výrobě. Je vhodná pro QA/QC laboratoře a pro výzkum fosforylace proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace s hmotnostní spektrometrií pro přesnou identifikaci PTM, automatizace přípravy vzorků, použití nano-HPLC a pokročilých analytických sloupců pro vyšší citlivost a komplementární metody pro obohacení fosfopeptidů (TiO2, IMAC).

Závěr

Reverzně-fázová HPLC na kolonce Acclaim 300 C18 ve spojení s trypsinovou digescí a ošetřením alkalickou fosfatázou poskytuje spolehlivou platformu pro peptidové mapování ovalbuminu a identifikaci fosforylovaných zbytků s vysokou opakovatelností.

Reference

• Kauffman JS. Analytical Testing to Support Biopharmaceutical Products. Biopharm. International 2007; 20–25.
• Dionex Corp. Phosphopeptide Enrichment Using a TiO2 Nano Precolumn. Application Note 531, LPN 1898.
• Knight Z.A. et al. Phosphospecific Proteolysis for Mapping Sites of Protein Phosphorylation. Nat. Biotechnol. 2003;21:1047–1054.
• Boerner R. et al. Identifying and Modulating Disulfide Formation in the Biopharmaceutical Production of a Recombinant Protein Vaccine Candidate. J. Biotechnol. 2003;103:257–271.
• Pierce Biotechnology. Instructions for BCA Protein Assay Kit. Doc. No. 1296.
• Bigelow CC, Channon M. Hydrophobicity of Amino Acids and Proteins. In: Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 1: Proteins. CRC Press; 1976:209–243.
• Rohrer JS et al. Identification, Quantification, and Characterization of Glycopeptides in Reversed-Phase HPLC Separations of Glycoprotein Proteolytic Digests. Anal. Biochem. 1993;212:7–16.