High-Resolution Cation-Exchange Alternative to Peptide Mapping for Protein ID and QA/QC

Význam tématu

High-rozlišovací kation-výměnná chromatografie nabízí alternativní či doplňkový přístup k tradičnímu metodickému repertoáru peptide mappingu založeného na reverzní fázi. Umožňuje odlišnou selektivitu založenou na elektrostatických interakcích, zlepšuje rozlišení proteinových variant a podporuje kvalitativní i kvantitativní kontroly při vývoji biofarmaceutik a v proteomických aplikacích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo zavést a ověřit vysoce účinnou metodu cation-exchange peptide mappingu využívající analytické kolony ProPac SCX-10 a novou generaci MabPac SCX-10. Studie porovnává efekt pH a organických modifikátorů, různých tokových rychlostí i porovnání s klasickou reverzní fází (C18) za použití formiové kyseliny a TFA jako mobilních fází.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: tryptický digest myoglobinu a syntetický peptid s pI 11,4
Sample prep: redukce, alkylace, dialýza v 50 mM NaHCO₃, následné přečištění a přes noc enzymatická štěpení trypsinem
Mobilní fáze: 20 mM TEAP (pH 2,0 nebo 3,9) v 50 % acetonitrilu (A) a stejné složení doplněné 100 mM NaClO₄ (B)
Gradienty a průtoky: 0–100 % B v rozsahu 10–40 min, průtok 0,7–1,4 mL/min, teplota 30 °C, detekce UV 214 nm

• Kolony: ProPac SCX-10 (10 µm, 4×250 mm); MabPac SCX-10 (3 µm, 4×50 mm)
• Zařízení: Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 ×2 LC systém (duální gradientní pumpa, autosampler s fraction collector, termostat
• Detektor: DAD-3000 (diode array), data systém Chromeleon 6.80+
• Pomůcky: Orion 2-Star pH metr

Hlavní výsledky a diskuse

• Myoglobinový digest: plynulý gradient TEAP/NaClO₄ umožnil vysoké rozlišení při různých průtocích; vyšší rychlosti až 1,4 mL/min zkrátily separaci bez ztráty kvality špiček.
• Syntetický peptid: lepší rozlišení pozorováno při pH 3,9 vs. pH 2,0, vliv elektrostatických a hydrofilních interakcí spolu s acetonitrilem.
• Porovnání s reverzní fází: ProPac SCX-10 dosáhl s formiovou kyselinou kapacity ~73, oproti 79 (PA2) a 140 (C18). Při použití TFA dosahuje reverzní fáze podstatně vyšších hodnot (136 a 158), avšak kation-exchange poskytuje konzistentní a reprodukovatelnou alternativu.
• MabPac SCX-10 (3 µm) zkracuje separační čas k <10 min, zvyšuje účinnost a zlepšuje rozlišení zejména blízkých peptidových komponent.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda rozšiřuje spektrum analytických postupů pro proteiny a peptidy, slouží jako doplňkový nebo náhradní přístup k reverzní fázi v QA/QC bioléčiv a v proteomice. Umožňuje lépe odlišit blízké varianty a nečistoty, usnadňuje validaci a sledování stability.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření kation-exchange ve vícerozměrných LC-MS workflow, integrace s vysokorychlostními mikro- a nano-LC systémy, automatizace pro vysokopropustné screeningy a zdokonalení povrchových chemických modifikací částic pro ještě vyšší selektivitu a kapacitu.

Závěr

ProPac a nová MabPac SCX-10 představují robustní a vysoce rozlišovací platformu pro peptide mapping, nabízejí rychlou, reprodukovatelnou alternaci či doplněk reverzní fáze a přinášejí významné výhody zejména v aplikacích QA/QC a proteomice.

Reference

1. Dionex Application Note 521: Automated 2D LC Coupled to ESI-MS/MS for the Analysis of Complex Peptide Samples, Sunnyvale, CA, 2002.
2. Dionex Application Note 126: Determination of Hemoglobin Variants by Cation-Exchange Chromatography, Sunnyvale, CA, 2007.
3. Dionex Application Update 183: Separation of Peptides from Enzymatic Digestion of Different Acclaim Columns, Sunnyvale, CA, 2011.
4. Dionex Technical Note 74: High Peak Capacity Nano LC Peptide Separations Using Long Packed Columns, Sunnyvale, CA, 2009.