Separation of Biochemical Buffering Agents Using Multi-Mode Liquid Chromatography with Charged Aerosol Detection

Význam tématu

Biochemické pufry jako Goodovy pufry jsou nezbytné pro stabilní řízení pH v biologických a analytických aplikacích. Mají nízkou UV absorbanci, minimální interakci s kovovými ionty a biologickou inertnost, což z nich činí ideální složky pufrovacích směsí. Jejich analýza však bývá složitá kvůli slabé UV aktivity a různorodé iontové povaze.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout univerzální chromatografickou metodu pro oddělení 22 běžných pufrovacích složek (zahrnujících Goodovy bufry, anorganické ionty a TRIS) v jediné analýze. Metoda využívá kombinované retenční mechanismy (aniontová výměna, kationtová výměna, HILIC) na jednom chromatografickém sloupci s následnou detekcí nabitými aerosolovými částicemi.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit sloupec Acclaim Trinity P2 (100 × 3 mm, 3 µm) na systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000. Mobilní fáze sestávala ze směsi acetonitrilu a 100 mM amonného formiátu (pH 3,65) v poměru 79:21 (v/v). Průtok činil 0,60 ml/min, teplota kolony 20 °C, objem injekce 5 µl. Detekce probíhala Corona Veo Charged Aerosol Detektorem při 55 °C a tlaku dusíku 60 psi. Data zpracováno v softwaru Chromeleon 6.8 SR13.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila rozlišení všech 22 analyzovaných látek v časech retence od přibližně 1,95 min (CHES) až do 26,64 min (TRIS). Zwitteriontické pufry se zadržují převážně HILIC interakcí, anorganické ionty (chlorid, fosfát, sodík) iontovou výměnou a TRIS kombinovaně oběma mechanismy. Optimalizace teploty (20 °C) a poměru mobilních fází zlepšila rozlišení blízkých píků, zejména chloridu a MOPSO.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorázové rozdělení širokého spektra pufrů a iontů v isokratických podmínkách.
• Zjednodušení QC a analýzy zbytků pufrů v bioproduktech.
• Univerzální detekce nevolatilních látek bez nutnosti výměny detektorů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření aplikace multi-mode sloupce pro komplexní formulace farmaceutických přípravků a biotechnologických produktů. Kombinace CAD s hmotnostní spektrometrií by mohla zvýšit selektivitu a citlivost. Dále se počítá s automatizovanou metodickou optimalizací pomocí strojového učení.

Závěr

Popsaná metoda na sloupci Acclaim Trinity P2 s detekcí Corona Veo CAD poskytuje efektivní a univerzální nástroj pro kvalitativní i kvantitativní analýzu širokého spektra biochemických pufrů a iontů v jediné separaci, čímž zjednodušuje provoz a zvyšuje robustnost analytických protokolů.

Reference

1. Good NE, Winget GD, Winter W, Connolly TN, Izawa S, Singh RMM. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 1966;5(2):467–477.
2. Good NE, Izawa S. Hydrogen Ion Buffers. Methods Enzymol. 1972;24:53–68.
3. Good’s buffers. Wikipedia; dostupné online.