Screening of Sample Matrices and Individual Matrix Ingredients for Suitability in AAA-Direct™

Význam tématu

Analýza aminokyselin v komplexních matricích je klíčová pro mnoho oblastí od potravinářského průmyslu po biotechnologii. Elektrochemická detekce pomocí metody AAA-Direct poskytuje citlivé a selektivní stanovení bez nutnosti derivatizace. Nicméně přítomnost složek vzorku může ovlivnit separaci a signál na elektrochemickém detektoru, proto je nezbytné skrínovat vzorkové matrice na možné interference.

Cíle a přehled studie

Cílem technické zprávy je popsat standardizovaný postup pro hodnocení vlivu složek vzorkové matrice (označovaných jako test sample, TS) na stanovení aminokyselin metodou AAA-Direct. Studie demonstruje tuto proceduru na příkladu ethanolu v rozsahu 0,1–50 % (v/v) a uvádí možná omezení, jako je koeluce s Arg nebo fouling elektrody.

Použitá metodika a postup

Vzorky a standardy:

• Aminokyselinový mix (17 AK, 9,6–11,6 µM) připravený z NIST SRM 2389 a Trp 250 µM.
• Testovaný vzorek: ethanol v 0,1, 1, 3, 10 a 50 % (v/v).

Analytický postup:

• Autosampler injekce sekvence: voda, triplikáty standardu, TS, TS + standardy, opět standardy.
• Hodnocení: posun retenční doby, změny plochy a výšky signálu před a po vystavení TS.
• Výpočet matričních efektů a post-TS efektů pomocí 99% intervalů spolehlivosti.

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém Dionex BioLC s pumpou GP50/GS50 (microbore, PEEK, degas).
• Elektrochemický detektor ED50 s programovatelnou pulzní amperometrií.
• Autosampler AS50 s tepelným oddělením a smyčkou 25 µL.
• Eluent organizer EO1, tři lahve 2 L a regulátor tlaku.
• Software Chromeleon Workstation.
• Sterilní mikrocentrifugační zkumavky, filtr 0,2 µm nylon, dusík 4.8 (99,998 %).

Hlavní výsledky a diskuse

Test ethanolu ukázal výraznou koeluci s argininem již při 3 %, což překrylo špičku Arg a ovlivnilo i včasně eluující AK (Lys, Ala, Gly, Val). Plochy a výšky signálů těchto AK klesaly až o 20–40 % s rostoucí koncentrací ethanolu. Retenční doby zůstaly relativně stabilní (<3 % změna), i při 50 % ethanolu. Post-TS injekce prokázaly fouling elektrody při vysokých koncentracích ethanolu, který se však postupně samočisticími pulzy částečně obnovoval. Podobné skrínování nitritu a sulfitu prokázalo, že sulfite koeluje s Asp a reakční produkty ovlivňují plochu signálu.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaný postup umožňuje rychlou a systematickou kontrolu vhodnosti vzorkové matrice pro elektrochemickou analýzu aminokyselin bez nutnosti časově náročného optimalizačního experimentu. Rozlišení matričních efektů od foulingu elektrody usnadňuje rozhodnutí o úpravě přípravy vzorku nebo parametrech chromatografie. Postup lze adaptovat i pro jiné elektrochemické metody (karbohydráty, antibiotika).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se vyšší automatizace vyhodnocení a reportingu v rámci LIMS nebo Chromeleonu, rozšíření skrínování na biofluidy a složité fermentační matrice a integrace online čisticích kroků (např. SPE). Využití strojového učení pro predikci možných interferencí z chemické struktury složek vzorku by mohlo dále zrychlit validaci metod.

Závěr

Navržená skrínovací procedura pro AAA-Direct prokázala robustnost a flexibilitu při identifikaci matričních interferencí a foulingu elektrody. Poskytuje jasná kritéria pro rozhodování o vhodnosti vzorku a pomáhá optimalizovat chromatografické a detekční podmínky.

Reference

• Dionex Corporation. Installation Instructions and Troubleshooting Guide for the AAA-Direct Amino Acid Analysis System; 031481.
• Dionex Corporation. Determination of the Amino Acid Content of Peptides by AAA-Direct; Technical Note 50.
• Jandik P. et al. New Technique for Increasing Retention of Arginine on an Anion-Exchange Column. Anal. Biochem. 2000, 287, 38–44.
• Dionex Corporation. Determination of Sulfite in Food and Beverages by Ion Exclusion Chromatography with Pulsed Amperometric Detection; Application Note 54.