ATE: Capillary Electrophoresis – Mass Spectrometry for Intact Mass Analysis of Antibodies and Antibody-Drug-Conjugate

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) a konjugované protilátky s léčivy (ADCs) představují klíčové terapeutické látky v biotechnologickém průmyslu. Jejich heterogenita, daná různými posttranslačními modifikacemi a rozdíly v náložích léčiv, ovlivňuje účinnost, bezpečnost a stabilitu přípravků. Rychlá a spolehlivá analýza intact proteoform poskytuje kritické informace pro vývoj, kontrolu kvality a schvalování těchto biopolymerů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout vysoce efektivní top-down analytický protokol pro separaci a hmotnostní analýzu intact mAbs a ADCs. Studie demonstruje integraci mikrofluidické kapilární elektroforézy (CE) na ZipChip se špičkovým orbitrapovým hmotnostním spektrometrem Q Exactive HF s Biopharma rozšířením a specializovaným softwarem BioPharma Finder 2.0.

Použitá metodika

Vzorek referenční NIST mAb RM 8671 i jeho ADC deriváty byly naředěny na 0,5 μg/μl vodou bez dalšího odsolení. Mikrofluidický chip obsahoval 22 cm dlouhý separační kanál s BGE složenou z 0,2% kyseliny octové a 10% isopropanolu (pH 3,17). Vzorek byl tlakově injikován (2 psi, 4 s), následoval CE separační krok při 20 kV a nano-ESI při 2 kV. Celkový čas analýzy nepřesáhl 3 minuty. Data byla dekonvoluována v BioPharma Finderu s modulem ReSpect pro přesnou hmotnost intact proteoform.

Použitá instrumentace

• Mikrofluidický ZipChip od 908 Devices s 22 cm kapilárou a integrovanou nano-ESI emisí
• Orbitrapový hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Q Exactive HF Biopharma (m/z 2 500–6 000, do 8 000 Da, 6 scan/s)
• Software Thermo Scientific BioPharma Finder 2.0 (ReSpect dekonvoluce, správa sekvencí a PTM, databázové porovnání)

Hlavní výsledky a diskuse

• Byly rozlišeny tři lysinové varianty NIST mAb (0, 1 a 2 C-terminální lysiny) díky odlišnému elektroforetickému mobilitnímu chování.
• Identifikováno bylo minimálně 15 glykoform včetně hlavních G0F/G0F, G0F/G1F, G1F/G1F, G1F/G2F a G2F/G2F variant.
• ADC modely s payloady AF488, biotin a dylight800 vykázaly očekávané heterogenity; pro AF488 a biotin potvrzeny dva náboje (1 payload na N-glykan), u dylight800 byla pozorována komplexnější distribuce.
• Relativní množství variant pokrývalo řádově tři řády, což dokládá široký dynamický rozsah metody.
• Přestože separace probíhá v kyselém prostředí, proteiny si zachovaly téměř nativení rozdíl nábojového stavu (26–31), což usnadňuje přirozenou interpretaci.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol nabízí rychlou, minimálně invazivní analytiku intact proteoform s velmi malou spotřebou vzorku (0,2 ng). Vhodný je pro rutiní kontrolu kvality biopharma výrobků, vývoj nových kandidátů a k potvrzení konformace a modifikací v reálném čase bez předchozího štěpení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace elektroforetických podmínek a modulů pro vyšší rozlišení složitějších ADC struktur.
• Integrace s iontově-mobilitní spektrometrií a pokročilými algoritmy strojového učení pro automatizovanou dekonvoluci.
• Rozšíření na další biologické molekuly, včetně bispecifických protilátek a rekombinantních proteinů.
• Implementace do online monitorování výrobních procesů a kontrolních linií GMP.

Závěr

Prezentovaná kombinace mikrofluidické CE a HRAM Orbitrap MS s BioPharma Finderem umožňuje rychlou a spolehlivou analýzu intact mAbs a ADCs. Metoda poskytuje detailní profil charge/glykoformových variant a podporuje rozhodování ve vývoji i kontrole kvality biotherapeutik.

Reference

• John E. Schiel, Darryl L. Davis, Oleg V. Borisov “State-of-the-Art and Emerging technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization: The NISTmAb Case Study”, ACS 2015
• Erin A. Redman, J. Scott Mellors, Jason A. Starkey, Michael Ramsey “Characterization of Intact Antibody Drug Conjugate Variants Using Microfluidic Capillary Electrophoresis – Mass Spectrometry”, Anal. Chem. 88, 2220–2226 (2016)