Novel Hydrophobic Interaction HPLC Columns

Význam tématu

Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) představuje jednu z nejdůležitějších ortogonálních metod pro charakterizaci monoklonálních protilátek (mAbs) a příbuzných biologik. Díky šetrnému režimu zachovává nativní strukturu proteinů a umožňuje sledovat heterogenitu vznikající post-translačními modifikacemi či agregací.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu je představit rodinu HIC kolon MAbPac od Thermo Scientific, navržených pro vysoce selektivní, účinné a robustní dělení mAbs, jejich fragmentů, oxidovaných forem, agregátů i konjugátů s cytotoxiny (ADC). Popisuje chemii stacionární fáze, charakteristiky jednotlivých sloupců a ukázky aplikací.

Použitá metodika a instrumentace

Hydrofobní interakční chromatografie pracuje tak, že v mobilní fázi s vysokou koncentrací soli dochází k navázání proteinů na hydrofobní ligandy na stacionární fázi. Snižováním koncentrace soli se proteiny elují podle vzrůstající hydrofobity.

• Mobilní fáze A: 1,5–2 M amonium síran, 50–100 mM fosfátový pufr, pH ~7.
• Mobilní fáze B: 100 mM fosfátový pufr, pH ~7 a různé poměry isopropanolu (u ADC).
• Gradient: lineární pokles % soli typicky 0–100 % B v rozsahu 10–35 min.
• Detekce: UV při 280 nm, teplota 20–30 °C.

Použitá instrumentace

Testy byly provedeny na HPLC přístrojích vybavených UV detektorem a MAbPac HIC kolony:

• MAbPac HIC-10 (5 µm, 4,6 ×100 a 4,6 ×250 mm).
• MAbPac HIC-20 (5 µm, 4,6 ×100 a 4,6 ×250 mm).
• MAbPac HIC-Butyl (5 µm, 4,6 ×100 mm).

Hlavní výsledky a diskuse

Rodina HIC kolon poskytuje široké spektrum selektivity:

• HIC-10 exceluje v separaci intaktních mAbs a agregátů.
• HIC-20 je vhodná pro fragmenty (Fab/Fc), oxidované formy a bispecifické protilátky.
• HIC-Butyl je optimalizována pro ADC s různými DAR hodnotami (0–8), které se elují postupně podle rostoucí hydrofobity.

Příklady rozlišení:

• ADC se 0–8 navázanými molekulami – dobře rozlišené píky na HIC-Butyl.
• Směs proteinů (myoglobin, ribonukleáza, lysozym, α-chymotrypsinogen) – vysoká účinnost na HIC-10.
• Aglomeráty a varianty intaktní mAb – oddělení agregátů a variant souběžně na HIC-10.
• Papainová štěpení – oddělení Fab a Fc fragmentů a jejich variant na HIC-20.
• Oxidované mAb – vysoce rozlišené oxidované formy bez nutnosti další úpravy vzorku na HIC-20.

Přínosy a praktické využití metody

HIC umožňuje:

• Komplexní profilaci heterogenity mAbs a ADC v různých vývojových fázích.
• Monitorování agregace, oxidace a jiných modifikačních dějů relevantních pro stabilitu a účinnost léčiva.
• Rozšíření analýzy nad rámec CEX a SEC díky komplementární selektivitě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj HIC kolon pro vysokoprůtokovou a mikro-LC, integrace s MS detekcí pro detailní charakterizaci modifikací, automatizace pro online monitorování výrobních procesů a aplikace na nové biologické entity jako bispecifické protilátky či glykoformy.

Závěr

Rodina MAbPac HIC kolon nabízí robustní, vysoce selektivní a bio- kompatibilní řešení pro detailní analýzu mAbs, jejich fragmentů, agregátů, oxidovaných variant i ADC. HIC se stává klíčovou technikou v biopharmaceutickém výzkumu i výrobě.

Reference

Thermo Fisher Scientific. MAbPac HIC Columns Application Note (BR21089-EN, 2016).