Adeno-associated virus capsid protein characterization and host cell protein profiling using micro-flow UHPLC-Orbitrap MS

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) jsou klíčovými vektory pro genovou terapii díky vysoké účinnosti a bezpečnosti. Charakterizace virových kapsidových proteinů a zbytkových proteinů hostitelské buňky (HCP) je nezbytná pro ověření kvality, bezpečnosti a účinnosti přípravků AAV. Přesná identifikace sekvencí, lokalizace posttranslačních modifikací (PTM) a analýza HCP přispívají k minimalizaci imunogenicity a zajištění stability produktu.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout robustní mikroprůtokovou LC–MS/MS metodu pro potvrzení sekvence, lokalizaci PTM a relativní kvantifikaci kapsidových proteinů AAV6.
• Stanovit metodu pro identifikaci a relativní kvantifikaci HCP v hrubém a purifikovaném vzorku AAV6.

Použitá metodika a instrumentace

Pro enzymatickou digesci kapsidových proteinů AAV6 byla použita pepsinová digesce (pH 2, 70 °C, 1,5 h) následovaná LC–MS/MS analýzou na mikrodávkovém UHPLC systému Vanquish Horizon spojeném s Orbitrap Exploris 480. Pro analýzu HCP proběhlo redukce DTT, alkylace IAC, tryptická digesce (37 °C, 2 h) a separace na kolóně PepMap 100 C18 (1,0 × 150 mm, 3 µm) při 80 µL/min.

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Horizon (Binary Pump H, Split Sampler HT, Column Compartment)
• Kolóna: PepMap 100 C18, 1,0 × 150 mm, 3 µm
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480
• Softwarové zpracování: BioPharma Finder 4.1

Hlavní výsledky a diskuse

Peptidová mapa dosáhla 100 % pokrytí sekvence VP1, VP2 a VP3 v jediném běhu. Nízkou abundanci PTM, jako fosforylace (< 0,5 %), oxidace (~ 0,6 %) a deamidace (~ 0,3 %), bylo možné jedinou analýzou detekovat a kvantifikovat. Kvalita spekter a citlivost metody umožnily jednoznačnou identifikaci i velmi vzácných modifikací.

V hrubém vzorku AAV6 bylo identifikováno 817 HCP s nejméně třemi unikátními peptidy, zatímco po purifikaci afinitní rezinou POROS AAVX zůstalo pouze 30 HCP. Relativní kvantifikace pomocí "top3" peptidů prokázala významné snížení HCP po purifikaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza díky mikrodávkovému toku na standardní UHPLC infrastruktuře.
• Vysoká robustnost a reprodukovatelnost srovnatelná s analytickým tokem LC.
• Integrované workflow pro PTM a HCP analýzu v jediném softwaru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření mikrodávkových LC–MS/MS metod pro charakterizaci široké škály virových vektorů a biologik. Automatizace datové analýzy, vyšší rozlišovací schopnost MS a integrace do výrobních procesů genové terapie povede ke zrychlení validace kvality a bezpečnosti.

Závěr

Popsaná mikroprůtoková UHPLC–Orbitrap metoda dosahuje vysoké citlivosti, úplného pokrytí sekvence a spolehlivé detekce nízkoabundantních PTM i HCP. Metoda je robustní, reprodukovatelná a vhodná pro rutinní kontrolu kvality AAV produktů.

Reference

• Samulski RJ, Muzyczka N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annu Rev Virol. 2014;1(1):427-451.
• Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL 3rd, Stroh W. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 2017;31:317-334.
• Popa-Wagner R, Porwal M, Kann M, Reuss M, Weimer M, Florin L, Kleinschmidt JA. Impact of VP1-Specific Protein Sequence Motifs on AAV2 Intracellular Trafficking and Nuclear Entry. J Virol. 2012;86(17):9163-9174.
• Wright JF. Product-Related Impurities in Clinical-Grade Recombinant AAV Vectors: Characterization and Risk Assessment. Biomedicines. 2014;2:80-97.
• Jin X, Liu L, Nass S, O’Riordan C, Pastor E, Zhang XK. Direct LC/MS Analysis for Complete Characterization of Recombinant AAV Capsid Proteins. Hum Gene Ther Methods. 2017;28(5):255-267.
• Rumachik NG, Malaker SA, Paulk NK. VectorMOD: Method for Bottom-Up Proteomic Characterization of rAAV Capsid PTMs and Vector Impurities. Front Immunol. 2021;12:657795.
• Johnson SX, Wheeler JX, Thorpe R, Collins M, Takeuchi Y, Zhao Y. MS Analysis Reveals Differences in HCP Species in Pseudotyped Lentiviral Vectors. Biologicals. 2018;52:59-66.
• Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer. Thermo Scientific, planetorbitrap.com.
• Viner R, Cardasis HL, Vitkovske V, et al. Development of an All-Recombinant Intact Protein Standard for LC & MS. Thermo Scientific Poster PO-21707. 2017.
• Eng JK, Jahan TA, Hoopmann MR. Comet: An Open-Source MS/MS Sequence Database Search Tool. Proteomics. 2013;13(1):22-24.
• Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP, Geromanos SJ. Absolute Protein Quantification by LC-MSE. Mol Cell Proteomics. 2006;5(1):144-156.
• Toole EN, Dufresne CP, Ray S, et al. Rapid Highly Efficient Digestion and Peptide Mapping of AAV. Anal Chem. 2021;93(30):10403-10410.