Sensitive determination of vitamin B6 in blood samples via fluorescence detection

Význam tématu

Vitamin B6 je klíčovým kofaktorem řady enzymů v nichž se podílí na metabolizmu aminokyselin, lipidů a sacharidů. Stanovení jeho hladiny v krevním séru či plazmě je důležitým parametrem při hodnocení nutričního stavu i diagnostice metabolických a zánětlivých onemocnění. Nízké koncentrace (v řádu nmol/l) vyžadují citlivé a spolehlivé analytické metody vhodné pro rutinní klinické laboratoře.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout rychlou, citlivou a jednoduchou metodu pro stanovení vitaminu B6 v krevních vzorcích bez nutnosti samostatného postkolonového derivačního zařízení. Využívá se UHPLC se sekvenčním bisulfitovým derivačním činidlem v mobilní fázi a fluorescenční detekcí.

Použitá metodika

Vzorky krve s protisrážlivým činidlem (EDTA) byly deproteinovány, odstředěny při 10 000 g a supernatant filtrován přes 0,45 µm membránový filtr. Pro kalibraci byla připravena řada standardů vitaminu B6 v rozsahu 26–260 nmol/l. Derivace vitaminu B6 na bisulfitový adukt probíhala přímo v mobilní fázi.

Parametry chromatografie:

• Kolona ProntoSIL 120-5 C18 AQ (125 × 3 mm ID, 5 µm) s integrovanou předkolonou
• Mobilní fáze A: 100 mM KH2PO4, 100 mM NaClO4, 0,5 g/l NaHSO3/acetonitril (97:3 v/v)
• Mobilní fáze B: acetonitril
• Gradient: izokratické 0–1,6 min 100 % A; 1,7–2,7 min 50 % A/50 % B; 2,8–5,0 min 100 % A
• Průtok 1,2 ml/min, teplota kolony 30 °C, objem injekce 10 µl
• Detekce fluorescenčním detektorem (Ex 290 nm, Em 400 nm, Gain ×16)

Použitá instrumentace

Pro analýzu byl použit systém PLATINblue UHPLC vybaven degaserem, autosamplerem, termostatem a fluorescenčním detektorem RF-20AXs. Kolona ProntoSIL C18 AQ zajistila optimální retenci a tvar píku vitamínu B6.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy standardů i skutečných vzorků ukázaly jasný a ostrý pik vitamínu B6 bez interferencí z matrice. Opakovatelnost retenčního času i plochy píku byla velmi vysoká (RSD < 0,7 %). Kalibrační křivka byla lineární v rozsahu 26–260 nmol/l s r2 > 0,999. Hranice detekce (LOD) dosahuje přibližně 1 nmol/l, kvantifikační mez (LOQ) kolem 3 nmol/l. Zahrnutí bisulfitové derivace v mobilní fázi odstranilo potřebu dodatečného postkolonového čerpadla, což zjednodušuje obsluhu a snižuje náklady.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (do 5 min včetně proplachu kolony)
• Vysoká citlivost pro nízké koncentrace vitaminu B6
• Jednoduchá příprava vzorku bez složité derivace
• Vhodné pro rutinní klinické i výzkumné laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Pro ještě rychlejší analýzu lze uvažovat o využití kolony s menšími částicemi nebo kratšími dimenzemi. Další směřování může vést k integraci s hmotnostní detekcí (UHPLC-MS) pro multiplexní stanovení řady vitamínů a metabolitů. Miniaturizace a plná automatizace vzorkování usnadní nasazení v nemocničních a výzkumných laboratořích.

Závěr

Vyvinutá metoda UHPLC s in situ bisulfitovou derivatizací a fluorescenční detekcí poskytuje rychlý, citlivý a robustní postup pro stanovení vitaminu B6 v krevních vzorcích. Díky jednoduché přípravě a absenci postkolonové derivace je ideální pro rutinní klinickou praxi.

Reference

1. Leklem JE. Vitamin B6. In: Machlin LJ, ed. Handbook of vitamins. Marcel Dekker, 1991:341–92.
2. Edwards P. A Simple Liquid-Chromatographic Method for Measuring Vitamin B6 Compounds in Plasma. Clin Chem. 1989;35(2):241–245.
3. Talwar D. Pyridoxal Phosphate Decreases in Plasma but not Erythrocytes during Systemic Inflammatory Response. Clin Chem. 2003;49(3):515–518.
4. Sanson ED. HPLC Analytik der B6-Vitamere: Methodenoptimierung und Referenzwerterstellung. Disertační práce, Lübeck 2008.
5. Kimura M. Highly sensitive and simple liquid chromatographic determination in Plasma of B6 vitamers, especially pyridoxal 5´-phosphate. J Chromatogr A. 1996;722:295–301.