Determination of Vitamin B6 in Blood Samples with Fluorescence Detection after Derivatization with Bisulfite

Význam tématu

Vitamin B6 je nezbytný koenzym v metabolismu aminokyselin, sacharidů i lipidů. Jeho stanovení v krvi je klíčové pro diagnostiku nutričních deficiencí, neurodegenerativních onemocnění a pro monitorování klinických terapií. Rychlá a citlivá metoda umožňuje pravidelnou kontrolu stavu pacienta i kvalitu klinických a výzkumných analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje validovanou HPLC metodu v reverzní fázi s fluorescenční detekcí po derivatizaci bisulfitem. Cílem je dosáhnout jednoduché přípravy vzorku, vysoké specificity a citlivosti bez nutnosti dodatečného postkolonního přidávání činidla.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhá v RP-HPLC s následujícími podmínkami:

• Kolona: ProntoSIL 120-5 C18 AQ, 125 × 3 mm ID s integrovanou prekolonou
• Mobilní fáze A: 100 mM KH2PO4, 100 mM NaClO4, 0,5 g/l NaHSO3 a acetonitril (97:3 v/v)
• Mobilní fáze B: acetonitril
• Gradient: 0–1,6 min 0 % B; 1,6–1,7 min nárůst na 50 % B; 1,7–2,7 min 50 % B; 2,7–2,8 min návrat na 0 % B; 2,8–5 min 0 % B
• Průtok: 1,2 ml/min
• Teplota kolony: 30 °C
• Objem injekce: 10 µl
• Detekce: Fluorescenční detektor Ex 290 nm, Em 400 nm, senzitivita High, zesílení ×16, snímkovací frekvence 5 Hz, čas odezvy 0,1 s
• Derivatizace: in situ bisulfitová příměs v mobilní fázi, bez postkolonního přidávání reagentu

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala dobrou linearitu v klinicky relevantním rozsahu, nízký detekční limit a reprodukovatelnou retenci B6 vitamínu. Chromatogram standardu a vzorku krve ukázal jasnou separaci a vysoký signál bez interferencí metodou derivatizace bisulfitem.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá analýza (do 5 minut) minimalizuje čas provozu laboratoře. Jednoduchá příprava vzorku a absence dodatečného činidla po koloni zjednodušují workflow a snižují riziko kontaminace. Metoda je plně automatizovatelná pro rutinní klinické laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s mikrofluidními systémy pro point-of-care testy
• Multiplexní stanovení vitamínů skupiny B v jedné analýze
• Vývoj ještě citlivějších detektorů pro monitoring stopových hladin
• Nasazení metody v rozvojových zemích díky jednoduché přípravě vzorku

Závěr

Popsaná RP-HPLC metoda s in situ bisulfitovou derivatizací nabízí rychlé, citlivé a spolehlivé stanovení vitaminu B6 v krevních vzorcích bez nutnosti složité přípravy. Díky malé spotřebě mobilní fáze a vysoké automatizaci je vhodná pro klinické i výzkumné aplikace.

Reference

V textu nebyly uvedeny explicitní literární zdroje.