Separation of Pyrimidine and Purine Bases in HILIC mode with AZURA Compact

Význam tématu

Separace purinových a pyrimidinových bází představuje klíčový krok v analýze biologických vzorků, farmaceutických preparátů i metabolomických studií. Díky své vysoké polaritě jsou tyto sloučeniny náročné na chromatografické rozlišení v běžných reverzních fázích. HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) nabízí účinnou alternativu pro spolehlivou a opakovatelnou separaci těchto analytů.

Cíle a přehled studie

Cílem metody bylo ověřit možnost izokratické separace uracilu, adeninu a cytosinu pomocí HILIC režimu na přístroji AZURA Compact. Studie se zaměřila na optimální složení eluční fáze, parametry průtoku a detekci za účelem dosažení dobrého rozlišení, krátkého analýzního času a reprodukovatelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

ULIST

Chromatograf: Knauer AZURA Compact v HILIC režimu

Kolona: Eurospher II 100-5 HILIC, 150 × 3 mm (obj. č. 15CE120E2J)

Mobilní fáze:

• A: 5 mM acetát amonný, pH 4,3
• B: acetonitril
• Izokratický poměr: 80 % B

Průtok: 0,6 ml/min

Teplota: 25 °C

Objem injekce: 1 μl

Detekce: UVD 2.1L, 254 nm, 20 Hz, kyveta 10 mm

Použité látky:

• 3,5-Di-tert-butyltoluene (9,2 mg/ml) – marker mrtvého času
• Adenin (0,15 mg/ml)
• Cytosin (0,20 mg/ml)
• Uracil (0,14 mg/ml)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila jasnou baseline separaci markeru a tří bází v časech odpovídajících pořadí:

1. 3,5-Di-tert-butyltoluene (marker mrtvého času)
2. Uracil
3. Adenin
4. Cytosin

Rozlišení mezi jednotlivými póly bylo dostatečné pro kvalitativní i kvantitativní analýzu. Izokratický režim přinesl stabilní retenční doby a nízkou spotřebu mobilní fáze, což zvyšuje reprodukovatelnost a snižuje celkové náklady.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda v HILIC režimu na AZURA Compact nabízí rychlou a robustní separaci polárních bází s minimálním časem přípravy a jednoduchou optimalizací. Vhodná je pro:

• Kvalitativní a kvantitativní stanovení purinů a pyrimidinů v biologických matricích
• Kontrolu kvality farmaceutických surovin a hotových přípravků
• Metabolomické studie zaměřené na sledování buněčných metabolitů

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj chromatografických sloupců s vylepšenou selektivitou pro polární analyty, integrace HILIC s hmotnostní spektrometrií a miniaturizace systémů slibují další zvýšení citlivosti a rychlosti analýz. Automatizace přípravy vzorků a pokročilé datové zpracování přispějí ke zjednodušení workflow v klinické a průmyslové praxi.

Závěr

Izokratická HILIC metoda na platformě AZURA Compact pro separaci uracilu, adeninu a cytosinu prokázala vynikající rozlišení, rychlost a reprodukovatelnost. Díky jednoduché metodice a minimální spotřebě mobilní fáze je vhodná pro rutinní analýzy v laboratořích zaměřených na biologii, farmaceutický výzkum a QA/QC.