Polar Analytes: C18 Didn’t Work, Now What?

Význam tématu

Analýza vysoce polárních analytů, jako jsou vodou rozpustné vitamíny, aminokyseliny či nukleové báze, představuje v reverzní fázi LC výzvu kvůli nízké retenci a jevu propadu fáze (pore dewetting). Robustní metodiky jsou nezbytné pro spolehlivou kvantifikaci v QA/QC a výzkumných aplikacích.

Cíle a přehled studie/článku

Studie se zaměřuje na identifikaci a srovnání alternativních přístupů k separaci polárních látek: úprava pH mobilní fáze, chromatografie s iontovou párovací činidlem, volba alternativních reverzních fází a hydrophilní interakční chromatografie (HILIC). Cílem je navrhnout postupy s lepší retencí, selektivitou a opakovatelností.

Použitá metodika a instrumentace

Byly testovány následující přístupy:

• Reverzní fáze RP-LC s C18/C8 column (Agilent Poroshell HPH-C18, ZORBAX SB-C18 RRHT, Bonus-RP, Phenyl-Hexyl, SB-Aq, EC-CN).
• Iontově párová chromatografie (IP) s alkylsulfonáty (např. heptansulfonát Na+) a čtvrtnými aminy (tetrabutylammonium).
• HILIC na stacionárních fázích typu silica, amide, diol (např. Poroshell 120 HILIC, ZORBAX Rx-Sil).
• Detekce DAD (210–260 nm), spektrometrie hmotnosti v aplikacích HILIC.
• Agilent 1200 LC systém, T = 25–60 °C, pH pufrů 2–7, organické složky ACN, methanol.

Hlavní výsledky a diskuse

• Propad fáze byl potvrzen u C18 při nízkém obsahu organiky (k’ < 2) zejména u vitamínů B.
• Úprava pH na 2,5 pozitivně ovlivnila retenci karboxylových skupin; při pH 7,5 docházelo ke ztrátě retence protonovaných kyselin.
• IP chromatografie s heptansulfonátem zvýšila k’ u 6 ze 10 vitamínů (B5 a B7 nebyly detekovatelné).
• Phenyl-Hexyl a SB-Aq fází dosáhly k’ > 2 pro sedm vitamínů; běžné C18 jen pro čtyři.
• HILIC poskytla dobrou retenci polárních analytů a vyšší citlivost v MS, avšak vyžaduje delší ekvilibraci.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje spolehlivou separaci a kvantifikaci vodou rozpustných vitamínů, aminokyselin, katecholaminů a nukleových bází.
• HILIC umožňuje přímé injekce ACN extraktů z SPE pro zjednodušení přípravy vzorku.
• IP chromatografie rozšiřuje možnosti analýzy iontově aktivních sloučenin bez derivatizace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj hybridních a dvourozměrných LC technik kombinujících RP a HILIC pro komplexní matice.
• Nové stacionární fáze se zvýšenou stabilitou proti fázovému kolapsu.
• Integrace s vysoce citlivou LC–MS/MS analýzou pro farmaceutické a metabolomické studie.

Závěr

Optimalizace chromatografických metod pro polární analytická činidla vyžaduje volbu mezi úpravou pH, IP chromatografií, alternativními RP fázemi a HILIC. Každý přístup má specifické výhody a omezení, přičemž kombinace několika technik může přinést nejlepší výsledky.

Reference

• Przybyciel P., Majors R. LCGC 20(6), 516–523 (2002).