Dye Harder with UNcle: Measure Thermal Stability with SYPRO

Význam tématu

Termální stabilita proteinů je základním parametrem při vývoji biologických léčiv a formulací. Měření teploty tání (Tm) a teploty agregace (Tagg) pomáhá předpovídat skladovatelnost, bezpečnost a účinnost proteinových léčiv. Rychlé a spolehlivé metody analýzy stability umožňují včasnou identifikaci nejvhodnějších variant a formulací.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na ukázku aplikace fluorimetrického barviva SYPRO Orange při diferenčním skenování (DSF) na platformě UNcle. Cílem bylo provést termální skenování lysozymu a monoklonální protilátky v různých pufrovacích podmínkách a koncentracích, měřit změny fluorescence barviva a světelného rozptylu pro sledování agregace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro stanovení termální stability bylo použito barvivo SYPRO Orange (5000×, Thermo Fisher #S6651) na konečnou koncentraci 20×, dále platforma UNcle se sealed multiwell cuvetami UNi (48 vzorků, 9 µl). Teplotní rampy probíhaly od 15 °C do 95 °C při 0,5 °C/min.

• Detekce fluorescence: excitace 473 nm, emise 510–680 nm, výpočet AUC pro stanovení Tm
• Detekce statického světelného rozptylu (SLS) na 473 nm pro určení Tagg
• Volitelně dynamický světelný rozptyl (DLS) pro analýzu velikosti agregátů

Hlavní výsledky a diskuse

Lysozym vykázal jednofázový termální přechod s Tm 67,2 °C, což odpovídá literárním hodnotám. Surové spektrální záznamy ukázaly dramatické zvýšení fluorescence nad ~60 °C. Monoklonální protilátka ve succinátovém pufru pH 5 podala dvojfázovou křivku s Tm1 62,7 °C a Tm2 76,3 °C, v PBS pH 7,4 byly hodnoty mírně posunuty (Tm1 66,1 °C, Tm2 75,6 °C). SLS detekce odhalila souběžný nárůst signálu u PBS, kde agregace nastupuje při ~75,5 °C a následně součástí agregátů klesá. Studie navíc ukázala, že i při širokém rozsahu koncentrací (0,05–100 mg/ml) byly vypočtené Tm poměrně konzistentní (<2 °C rozptyl), avšak extrémně vysoké koncentrace měly nižší fluorescenční signál a chybějící druhou fázi tání.

Přínosy a praktické využití metody

DSF s SYPRO Orange na UNcle nabízí vysokopropustnou analýzu stability při nízkém objemu vzorku a snadné přepínání mezi label-free a barvivovou technikou. Metoda umožňuje rychlé porovnání řady proteinových variant, formulací a podmínek, což zrychluje vývoj biologických léčiv a kvalifikované rozhodování v oblasti QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření automatizace a integrace s robotickými systémy pro vysokopropustné screeningy. Vznik nových barviv s optimalizovanou citlivostí a kompatibilitou s různými proteinovými typy umožní širší uplatnění DSF. Kombinace s dalšími bi-fyzikálními metodami a využití pokročilých algoritmů a AI pro analýzu spektrálních a rozptylových dat posílí možnosti predikce stability.

Závěr

Studie potvrdila, že SYPRO Orange ve spojení s platformou UNcle poskytuje robustní a reprodukovatelné stanovení termální stability a agregace proteinů v širokém spektru podmínek a koncentrací. Metoda je vhodná pro rychlé screeningy i hloubkovou charakterizaci biologických léčiv.

Reference

1. Lavinder JJ, Hari SB, Sullivan BJ, Magliery TJ. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J Am Chem Soc. 2009;131:3794–3795.
2. Niesen FH, Berglund H, Vedadi M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2007;2:2212–2221.