Fast & accurate DNA quantification with Lunatic

Význam tématu

Rychlá a přesná kvantifikace DNA je klíčová pro molekulární biologii, genomiku a diagnostické aplikace. Tradiční fluorescenční metody vyžadují přípravu standardní křivky a citlivé pipetování, což je časově náročné, náchylné k chybám a často neřeší interferující složky v krevních nebo tkáňových extraktech. Technologie Lunatic řeší tyto výzvy pomocí mikročipové UV/Vis spektrometrie, která minimalizuje spotřebu vzorku a souběžně poskytuje kvantifikaci i informace o čistotě vzorku.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl ukázat, jak systém Lunatic a jeho menší verze Little Lunatic:

• nabízí široký dynamický rozsah měření DNA bez potřeby barviv,
• zpracuje až 96 vzorků za 5 minut (16 vzorků za 2 minuty u Little Lunatic),
• používá algoritmy Unmix pro dekonvoluci absorbčních spekter a identifikaci příměsí,
• překonává omezení fluorescenčních metod (např. Qubit, PicoGreen) v přítomnosti solí a detergentů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro kvantifikaci byly použity:

• Lunatic UV/Vis čtečka (0,03–275 OD, 96 vzorků/5 min),
• Little Lunatic (1,5–13 750 ng/µl, 16 vzorků/2 min),
• High Lunatic destičky a mikročipy s 2 µl vzorku.

Pro ověření přesnosti se připravily roztoky kalfího thymu DNA v TE pufru, do kterých byly přidány standardní kuličky (500 nm NIST), RNA nebo BSA. Měření proběhlo aplikacemi “A260 dsDNA”, “dsDNA A260–bg(340)” a Unmix moduly (“DNA Mamm.”, “Nucleic Acids (DNA equiv.)”). Výsledky byly porovnány s fluorescenčními testy Qubit dsDNA BR a PicoGreen.

Hlavní výsledky a diskuse

1. UV/Vis kvantifikace Lunatic odhalila lineární odezvu bez potřeby ředění nebo přípravy standardní křivky. Unmix algoritmy úspěšně identifikovaly a oddělily spektroskopické příspěvky DNA, RNA, proteinů a solí.
2. Porovnání s Qubit a PicoGreen prokázalo, že fluorescenční metody výrazně podceňují koncentraci DNA při přítomnosti NaCl, zatímco Lunatic zachoval správné hodnoty těsně kolem teoretických 100 ng/µl.
3. Poměry A260/A280 (~1,8) a A260/A230 (>2) poskytují rychlou informaci o čistotě, zatímco Unmix výstupy kvantifikují kontaminanty (fenol, thiokyanáty) a umožňují korekci výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální objem vzorku (2 µl) šetří vzácné materiály.
• Automatizace a kompatibilita s pipetovacími workstacemi zvyšují propustnost laboratoří.
• Integrované metody detekce čistoty zajišťují validní data pro další kroky (NGS knihovny, klonování, qPCR).
• Volitelný 21 CFR Part 11 modul podporuje farmaceutickou a klinickou dokumentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že UV/Vis spektrofotometrie s algoritmickou dekonvolucí spekter bude dále rozšiřována o:

• moduly pro RNA kvantifikaci a metylaci DNA,
• implementaci strojového učení pro predikci kvality vzorků,
• možnosti dálkové správy a integraci s LIMS systémy,
• miniaturizaci pro point-of-care aplikace.

Závěr

Systém Lunatic představuje robustní platformu pro rychlou a spolehlivou kvantifikaci nukleových kyselin bez kompromisů v přítomnosti běžných kontaminantů. Díky širokému dynamickému rozsahu, mikrovzorkovému odběru a pokročilým Unmix algoritmům automatizuje a zjednodušuje proces kontroly kvality DNA v genomických pracovních postupech.

Reference

1. Dragan AI, et al. Characterization of PicoGreen interaction with dsDNA and the origin of its fluorescence enhancement upon binding. Biophysical Journal. 2010;99(9):3010–3019.
2. Singer VL, et al. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 1997;249(2):228–238.