High-throughput protein stability screens with Aunty

Význam tématu

V oblasti vývoje biologických léčiv je klíčové rychle a spolehlivě hodnotit termální stabilitu proteinů a jejich náchylnost ke srážení. Optimalizace formulací, konstrukčních variant či konjugátů vyžaduje vysoce výkonnou a automatizovatelnou platformu, která minimalizuje spotřebu vzorku a současně poskytuje rozsáhlá kvalitativní data o konformační a koloidní stabilitě.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo představit přístroj Aunty, který kombinuje detekci intrinsic fluorescencí, barvivově řízené skenování, statické (SLS) i dynamické (DLS) světelné rozptyly ve formátu křemenné destičky se 96 jamkami. Studie demonstruje, jak tento přístup umožňuje provádět vysoce paralelní termální skeny proteinových vzorků a rychle vyhodnocovat jejich rozvinutí, agregaci a velikost částic.

Použitá instrumentace

• SBS-formátová křemenná destička 96 jamková (8 µL vzorku/jamka)
• LED dioda 280 nm pro excitaci intrinsické fluorescence
• Vysokocitlivý spektrofotometr pro záznam fluorescence celého spektra
• Systém statického (SLS) a dynamického (DLS) světelného rozptylu
• Přesná termální jednotka s řízením rampy 15–95 °C (0,1–10 °C/min) a stabilitou ±0,1 °C
• Software pro automatizované řízení experimentu a vyhodnocení Tm, Tagg a Tsize

Použitá metodika

Proteinové vzorky (např. bovinní IgG či monoklonální protilátky) byly inkubovány ve zmíněných jamkách a zahřívány při definovaných rychlostech. Současně se snímala změna intrinsic fluorescence a barvivem odvozené signály, průměrná intenzita rozptylu (SLS) a rychlost změn rozptylu (DLS). Z křivek se pomocí 1. derivační metody určovalo Tm (bod roztavení) a ze změn SLS/DLS se získávala Tagg (teplota počátku agregace) a Tsize (zvětšení hydrodynamického průměru).

Hlavní výsledky a diskuse

• Limit detekce: 50 µg/mL pro SLS, 0,1 mg/mL pro DLS; reprodukovatelnost Tm i Tagg s CV ≤ 2 %.
• Bovinní IgG s 500 mM argininu vykázalo snížení Tm o 3,5 °C, Tagg se posunulo z 68,5 °C na 73,4 °C, Tsize o 2,5 °C výše oproti čistému PBS.
• Test 96 replikátů bovinní IgG v PBS ukázal průměrnou Tm 70,8 °C (CV 0,8 %) a Tagg 67 °C (CV 1,1 %).
• Srovnání 7 kombinací protilátek a excipientů (trastuzumab, pembrolizumab, NaCl, arginin) v jednom běhu prokázalo rozdíly v Tm a Tagg s CV < 2 %, což umožnilo rychle vybrat optimální formulace.

Přínosy a praktické využití metody

• Extrémně vysoká propustnost díky formátu 96 jamkové destičky a minimálnímu objemu (8 µL).
• Současné měření konformační stability (fluorescence) a koloidní stability (SLS/DLS).
• Automatizované řízení celého experimentu včetně importu vzorků, termální rampy a datové analýzy.
• Široké dynamické rozmezí koncentrací proteinů (0,025–300 mg/mL IgG).
• Rychlé cykly měření (data každou minutu) s vysokou spolehlivostí a opakovatelností.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace umělé inteligence pro přediktivní analýzu stability a výběr excipientů.
• Rozšíření metodiky na jiné biomolekuly, např. proteiny s více doménami či nanovírů.
• Vývoj nových fluorescenčních sond pro sledování specifických konformačních změn.
• Další miniaturizace a adaptace na high-content screening v mikrodestičkách s vyšší hustotou jamkování.

Závěr

Aunty představuje komplexní platformu pro vysokoprůchodové testování stability proteinů. Díky kombinaci intrinsic fluorescence, SLS a DLS v křemenné 96-jamkové destičce a precizní tepelné kontrole umožňuje efektivní screening formulací, konstrukčních variant i excipientů s minimální spotřebou vzorku a vysokou spolehlivostí výsledků. Tato technologie snižuje dobu a náklady spojené s vývojem nových biologických léčiv a poskytuje rozhodující podklady pro optimalizaci stability.

Reference

• Kamerzell TJ, et al. Protein-excipient interactions: Mechanisms and biophysical characterization applied to protein formulation development. Advanced Drug Delivery Reviews. 2011;63(13):1118–1159.