Multi-day biologics stability experiments with Uncle

Význam tématu

Stabilita biologických léčiv je klíčová pro zajištění jejich účinnosti, bezpečnosti a dlouhodobého skladování. Hodnocení termální stability a agregačních procesů proteinových látek pomáhá při optimalizaci formulací a identifikaci vhodných aditiv, jako je arginin, které mohou ovlivnit skládání a agregaci proteinů.

Cíle a přehled studie

Tato studie představuje více-denní izotermální experimenty stability lidské polyklonální IgG pomocí platformy Uncle. Hlavním cílem bylo porovnat vliv rostoucích koncentrací argininu (25–250 mM) na teplotu tání (Tm), teplotu onsetu agregace (Tagg) a časový průběh agregačních a konformačních změn při 58 °C po dobu 36 hodin.

Použitá metodika a instrumentace

Instumentace: platforma Uncle (Unchained Labs), vybavená detekcí intrinsic fluorescence, statického světelného rozptylu (SLS) a dynamického světelného rozptylu (DLS) s řízením teploty 15–95 °C.

Metodika:

• Termální rampy (15–95 °C při 0,5 °C/min) pro stanovení Tm (poměr fluorescence 350/330 nm) a Tagg (onset SLS při 266 nm).
• Izotermální měření při 58 °C po 36 h: fluorescence+SLS spektra každých 10 min; DLS čtyři akvizice každých 13 min pro sledování hydrodynamického průměru.
• Srovnání formulací: PBS vs. PBS s 25, 50, 100 a 250 mM argininu.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky termálních ramp ukázaly, že se zvyšující se koncentrací argininu klesá Tm (z 66,5 °C na 59 °C) a současně roste Tagg (z 57 °C na 65 °C). Izotermální průběhy potvrzují, že ve vzorku bez argininu dochází po ~25 h k rychlému vzniku velkých agregátů, zatímco při 250 mM argininu agregace prakticky neprobíhá. Dynamické světelné rozptyl ukázalo nárůst průměrného hydrodynamického průměru IgG z ~20 nm nad 250 nm v PBS, zatímco v přítomnosti 250 mM argininu se zvýšení o méně než 2×. Intrinsic fluorescence prokázala počáteční částečnou destabilizaci proteinové konformace v závislosti na koncentraci argininu.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma Uncle umožňuje ušetřit čas a materiál díky multiaplikacím na jednom přístroji, malým objemům vzorků (9 µl) a paralelnímu sledování stability, aglomerace a velikosti částic. Univerzální workflow urychluje vývoj biologických léků a optimalizaci formulací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření izotermálních protokolů na jiné typy proteinů a komplexní biologické molekuly. Integrace s automatizovaným vysokoprůchodovým screeningem i pokročilou analýzou dat (machine learning) může dále zlepšit prediktivní schopnosti stability a pomoci v návrhu robustních formulací.

Závěr

Studie demonstruje, že kontinuální izotermální měření na platformě Uncle efektivně rozlišuje účinek aditiv, jako je arginin, na stability a agregaci IgG. Díky kombinaci fluorescence, SLS a DLS lze ve stejném experimentu získat komplexní obraz konformačních a agregačních změn během několikadenního inkubačního období.

Reference

• Arakawa T, Ejima D, Tsumoto K, Obeyama N, Tanaka Y, Kita Y, Timasheff SN. Suppression of protein interactions by arginine: A proposed mechanism of the arginine effects. Biophysical Chemistry. 2007;127(1-2):1–8.
• Ishibashi M, Tsumoto K, Tokunaga M, Ejima D, Kita Y, Arakawa T. Is arginine a protein-denaturant? Protein Expression and Purification. 2005;42(1):1–6.