Figure out aggregation early: simultaneous, independent measurements of B22 and kD on Uncle

Význam tématu

Vývoj vysoce koncentrovaných biologických léčiv klade důraz na předcházení agregaci proteinů, která může negativně ovlivnit stabilitu a účinnost léčiva. Parametry kD a B22 patří mezi klíčové ukazatele kolloidní stability a sklonu proteinů k samosasociaci, a umožňují tak včasnou identifikaci rizikových podmínek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat simultánní a nezávislé měření difuzního interakčního parametru kD a druhého virialního koeficientu B22 na modelovém proteinu lysozymu při různých koncentracích NaCl. Provedení experimentu na platformě Uncle mělo ověřit rychlost, přesnost a úsporu vzorku při charakterizaci proteinových formulací.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experiment byly připraveny roztoky lysozymu v 10 mM acetátovém buffru pH 5,2 s 100 mM a 400 mM NaCl. Po filtračním očištění a odstředění byly děleny na 5, 10, 15 a 20 mg/mL. Instrumentace:

• Uncle – platforma pro simultánní statickou a dynamickou měření rozptylu (SLS, DLS)
• DLS – čtyři akvizice po 5 s pro výpočet difuzních koeficientů
• SLS – kalibrace intenzity vůči toluenu jako referenčnímu standardu
• Software Uncle Analysis – výpočet kD z hydrodynamického průměru a B22 z intenzity rozptylu

Hlavní výsledky a diskuse

Lysozym v 400 mM NaCl vykázal negativní hodnoty kD a B22, což indikuje atraktivní interakce a sklony k agregaci, odpovídající zákalu roztoku při nízkých teplotách. V 100 mM NaCl byly hodnoty těchto parametrů pozitivní, což odpovídá repulzivním interakcím a stabilně rozpuštěnému proteinu. Naměřené hodnoty kD a B22 byly ve shodě s publikovanými daty, přičemž rozdíly v řádech jednotek procent potvrdily spolehlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Simultánní získání dvou klíčových parametrů bez navýšení časové či materiálové náročnosti
• Možnost práce s nízkými koncentracemi a malými objemy vzorku
• Rychlou identifikaci podmínek vedoucích ke snížení rizika agregace
• Úsporu času v rané fázi vývoje biologických léčiv

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikace na další biologické makromolekuly, integrace s vysokoprůchodovými screeningovými platformami a využití AI pro predikci stability na základě rozsáhlých datových sad. Kombinace s metodami termální stability, kapalinové chromatografie a masové spektrometrie může dále zvýšit komplexnost charakterizace.

Závěr

Experiment na platformě Uncle prokázal efektivní, přesné a úsporné simultánní měření kD a B22. Metoda umožňuje včasné rozlišení stabilních a agregujících formulací, což usnadňuje výběr optimálních podmínek a snižuje riziko vzniku nežádoucích agregátů.

Reference

1. Shi S et al. Method qualification and application of diffusion interaction parameter and virial coefficient. International Journal of Biological Macromolecules 62(2013):487–493.