Uncle sets a new benchmark for protein characterization

Význam tématu

Charakterizace proteinů hraje klíčovou roli při vývoji a kontrole kvality biologických léčiv, zejména monoklonálních protilátek. Standardizované referenční materiály, jako NISTmAb, umožňují porovnání analytických metod napříč laboratořemi a urychlují proces formulace a stabilitního screeningu.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat schopnosti jednotné platformy Uncle pro komplexní analýzu stability a charakteristiky NISTmAb. Studie zahrnovala měření velikosti, polydisperzity, tepelné stability, tendence ke shlukování a stanovení interakčních parametrů (B22, kD) v různých formulacích.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzy byl použit systém Uncle: all-in-one platforma s přesnou regulací teploty (15–95 °C) a detekcí pomocí:

• fluorescenční spektroskopie,
• statického rozptylu světla (SLS),
• dynamického rozptylu světla (DLS).

Vzorky byly pipetovány do nízkovolumových quartzových cuvet Uni (až 48 pozic). Koncentrace proteinů se pohybovaly od 0,5 do 10 mg/mL ve třech různých pufrech (histidin, citrát+pufr, fosfát+pufr) s 200 mM NaCl.

Hlavní výsledky a diskuse

• Velikost a polydisperzita: NISTmAb v dodaném histidinovém pufru vykázala monodisperzní peak kolem 10 nm (PDI < 0,13) s minimálními změnami po tepelné šarži.
• Tepelná stabilita: Fluorescenční měření odhalila tři přechody Tm1≈67 °C, Tm2≈80 °C, Tm3≈90 °C v souladu s DSC daty NIST.
• Termální agregace: V histidinovém pufru bez výrazné SLS odezvy; v citrátovém pH 5 a fosfátovém pH 8,5 respektive prudký nárůst rozptylu ukazující tvorbu agregátů (hydrodynamický průměr až stovky až tisíce nm).
• Interakční parametry: V optimálním histidinovém pufru byly B22 a kD kladné (odpudivé interakce), zatímco v citrátovém a fosfátovém pufru se pohybovaly kolem nuly či záporných hodnot, naznačujících riziko samo-asociace.

Přínosy a praktické využití metody

Systém Uncle umožňuje rychlý, plně automatizovaný screening stability proteinů s nízkou spotřebou vzorku. Kombinace DLS, SLS a fluorescenční detekce v jediné šarži šetří čas a zajišťuje konzistentní data pro vývoj formulací, QC i výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací pro vysoce propustné screeningy (high-throughput formulation screening).
• Integrace s dalšími bioanalytickými technikami pro komplexní charakterizaci struktury a stability.
• Adaptace pro hodnocení nových proteinových konstrukcí a multimérních komplexů.

Závěr

Platforma Uncle prokázala vysokou spolehlivost a flexibilitu při charakterizaci standardního materiálu NISTmAb. Data odpovídají publikovaným výsledkům a současně poskytují doplňující informace o agregaci a interakcích v různých formulacích. To výrazně zkracuje dobu a snižuje rizika při vývoji biologických léčiv.

Reference

1. Schiel JE, Davis DL, Borisov OV (eds). State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization. In: Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study. American Chemical Society; Vol. 1201, 2015.