Assess aggregation risk at higher protein concentrations with G22

Význam tématu

Stabilita proteinů ve vysokých koncentracích je klíčová pro vývoj a výrobu biotechnologických léčiv. Slabé, nespecifické interakce mezi molekulami proteinů významně ovlivňují koloidní stabilitu a mohou vést k agregaci, která snižuje účinnost a bezpečnost finálního preparátu. Tradiční parametry jako difúzní interakční parametr kD a druhý virialový koeficient B22 poskytují spolehlivé informace pouze pro řídké roztoky (< 10 mg/ml). V praktických formulacích proteinů, kde se koncentrace pohybuje nad 10 mg/ml, je třeba zohlednit vliv tzv. crowding efektu. Kirkwood-Buffův integrál G22 se ukazuje jako vhodnější ukazatel pro hodnocení stability v těchto podmínkách, protože zachycuje krátkodobé intermolekulární interakce při vysokém zatížení roztoku proteiny.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat využití G22 pro hodnocení rizika agregace ve vysokých koncentracích proteinů pomocí platformy Uncle. Modelovými proteiny byly alpha-chymotrypsinogen a humanizované monoklonální protilátky (Adalimumab). Studie srovnala různé pufrové podmínky (fosfát pH 7 a acetát pH 5 s/bez 300 mM NaCl) a sledovala změny příznaků agregace u koncentrací 20–80 mg/ml (chymotrypsinogen) a 14–100 mg/ml (Adalimumab). Jedno experimentální nastavení umožnilo současné získání kD, B22 a G22.

Použitá metodika a instrumentace

Pro kalibraci přístroje byly využity standardní parametry měření intensit rozptylu toluenu. Alpha-chymotrypsinogen byl dialyzován do 10 mM sodného citrátu pH 3,5, poté inhibitorem PMSF vyřazen trypsin a formulován do 5 mM fosfátového pufru pH 7 nebo 40 mM acetátového pufru pH 5. Adalimumab byl přímo ošetřen v komerční formulaci pH 5,2. Vzorky (9 µL) byly měřeny v přístroji Uni/Uncle s detekcí statickým (SLS) a dynamickým rozptylem světla (DLS) a fluorescencí. Pro každý vzorek proběhly čtyři DLS akvizice po 5 sekundách. Software Uncle vypočítal hodnoty R90/K a na základě očekávané molekulové hmotnosti proteinu určoval G22 podle vztahu R90/K = MW_app·c + MW·G22·c^2.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro alpha-chymotrypsinogen ve fosfátovém pufru (s/bez NaCl) byla zjištěna rostoucí závislost R90/K na koncentraci, což indikuje atraktivní interakce (kladné G22). V acetátovém pufru bez soli vykazovaly vyšší koncentrace záporné G22, což svědčí o repulzivních silách mezi molekulami. Silnější atraktivní síly byly zaznamenány v přítomnosti 300 mM NaCl. Konverzí dat bylo možné částečně vypočítat kD a B22, avšak pro některé podmínky (vysoké koncentrace) tyto parametry překročily platnost definice a jejich hodnoty byly neplatné. U Adalimumabu se v rozsahu 14–100 mg/ml ukázalo záporné G22 při nejvyšší koncentraci, což potvrzuje net-repulzivní chování optimalizované komerční formulace.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost současného stanovení kD, B22 i G22 v jednom experimentu.
• Malý objem vzorku (9 µL) a vysoká propustnost (až 48 vzorků současně).
• Rychlé vyhodnocení stability proteinových formulací v rozličných pufrových podmínkách a koncentracích.
• Ušetření času a materiálu při vývoji biologických léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s počítačovým navrhováním mutací pro minimalizaci aggrefací.
• Rozšíření použití G22 na různé typy biologik a excipientů.
• Automatizace měření a využití strojového učení pro predikci stability.
• Kombinace s dalšími biophysical assay pro komplexní profilování proteinu.

Závěr

Platforma Uncle s metodou G22 nabízí robustní přístup pro hodnocení koloidní stability proteinů při vysokých koncentracích, který překonává omezení tradičních parametrů kD a B22. Umožňuje efektivní screening formulací, minimalizuje riziko agregace a přispívá k rychlejšímu vývoji bezpečných a stabilních bioloigických léčiv.

Reference

1. O’Brien CJ, Blanco MA, Costanzo JA, Enterline M, Fernandez EJ, Robinson AS, Roberts CJ. Modulating non-native aggregation and electrostatic protein-protein interactions with computationally designed single-point mutations. Protein Engineering, Design & Selection. 2016;29(6):231–243.
2. Woldeyes MA, Rubio CC, Furst EM, Roberts CJ. Predicting protein interactions of concentrated globular protein solutions using colloidal models. Journal of Physical Chemistry B. 2017;121:4756–4767.