Visualization of Abscisic Acid Distribution in Brown Rice Using Mass Spectrometry Imaging

Význam tématu

Fytohormony jsou v rostlinné biochemii centrálními signálními molekulami, které i v stopových koncentracích regulují růst, vývoj a reakce na stresové podmínky. Abscisová kyselina (ABA) je klíčová zejména při regulaci dormance semen, reakci na sucho a stresové stimuly. Přesná prostorová distribuce ABA v pletivech dosud nebyla snadno sledovatelná, což omezuje porozumění fázím jejího působení.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a demonstrovat metodiku zobrazování rozložení ABA v průřezech zralých zrn hnědé rýže Oryza sativa L. cv. Hinohikari za pomoci hmotnostně spektrometrického zobrazování (MSI) s vysokou citlivostí a prostorovým rozlišením. K tomu byly využity derivatizační činidlo Girard’s reagent T (GirT) a měřící soustava iMScope QT.

Použitá metodika

1. Příprava vzorku

• Odloupání slupek z hnědé rýže a embedding v 10 % želatině.
• Zmražení na –80 °C a krájení v kryostatu na 15 µm řezy.
• Uchování sekcí na kryofilmové pásce a zasušení.

2. Derivatizace a nanášení matrice

• Smíchání roztoku ABA se GirT (5 mg/ml v MeOH/H₂O/TFA 80/20/2) a reakce 30 min při pokojové teplotě.
• Nanesení GirT na plošnou preparaci airbrushem, reakce 30 min a zasušení.
• Nanesení matrix DHB (30 mg/ml v 70 % MeOH) airbrushem.

3. Hmotnostně spektrometrická analýza

• Použití iMScope QT v pozitivním iontovém módu (m/z 350–400), detekce GirT-ABA jako [M]+ při m/z 378,24.
• MS/MS fragmentace s argonem ukázala charakteristické fragmenty m/z 319,17 a 291,17.
• Pixe­lové rozlišení MSI: 25 µm × 25 µm.
• Pořízená data analyzována v softwaru IMAGEREVEAL MS.

Použitá instrumentace

• Imaging Mass Microscope iMScope QT (Shimadzu).
• MS data analysis software IMAGEREVEAL MS (Shimadzu).
• Kryostat CM1950 (Leica) pro přípravu tenkých řezů.
• Airbrush GSI Creos pro nanášení reagencií a matrice.
• ITO-potahované skleněné mikroskopické sklo s vodivou páskou 3M.

Hlavní výsledky a diskuse

Derivatizace ABA pomocí GirT vedla k výraznému zvýšení ionizační účinnosti oproti GirP a nelze­ramičeným vzorkům. Ve spektru byla detekována molekulární iontová špička GirT-ABA při m/z 378,24 a v MS/MS spektru charakteristické fragmenty m/z 319,17 (ztráta trimethylaminu) a m/z 291,17. MSI zobrazení v řezových preparátech hnědé rýže odhalilo koncentraci ABA především v oblasti embrya, zatímco endosperm vykazoval signifikantně nižší intenzitu signálu (p < 0,001).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje prostorové sledování rozložení stopových hormonů přímo v pletivech, což je klíčové pro studium stresové fyziologie semen, germinace a homeostatické regulace vody. Přesná lokalizace ABA pomůže optimalizovat zemědělské postupy, šlechtění odolných odrůd a hodnocení vlivu stresových faktorů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření derivatizační strategie na další skupiny fytohormonů (auxiny, cytokininy, jasmonáty). Integrace MSI s dalšími zobrazovacími technikami (např. Ramanova mikrospektroskopie). Vyšší prostorové rozlišení a kvantitativní přístupy pro detailnější analýzu drobných rostlinných orgánů. Aplikace v agrobiotech a monitorování zdravotního stavu plodin in situ.

Závěr

Popsaná procedura derivatizace ABA GirT a následného MSI na přístroji iMScope QT prokázala schopnost citlivé a prostorově rozlišené detekce ABA v hnědé rýži. Výsledky ukazují preferenční akumulaci v embryu a potvrzují vhodnost této metody pro studium distribuce fytohormonů v rostlinných pletivech.

Reference

1. Enomoto H., Sensu T., Yumoto E., Yokota T., Yamane H. Derivatization for detection of abscisic acid and 12-oxo-phytodienoic acid using matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 32, 1565 (2018).