Analysis of Citrate Distribution in Plant Tissues Using Multimodal Imaging

Význam tématu

Strukturální lokalizace metabolitů v rostlinných tkáních je klíčová pro pochopení jejich fyziologie, metabolismu a reakce na prostředí. Metody hmotnostní spektrometrie v zobrazovacím režimu (MSI) umožňují prostorové zobrazení molekul, avšak signál v pozitivním režimu často vzniká jako kovový adukt (např. [M+K]+). U rostlin může heterogenní distribuce kovových iontů (zejména K+) zkreslit interpretaci MSI obrazů. Kombinace molekulárního MSI s elementárním zobrazováním (LA-ICP-MS) a kvantitativním HPLC měřením poskytuje robustní přístup k validaci prostorového rozložení analyzovaných látek – v tomto případě citrátu ve fragaria (jahodě).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo posoudit, zda distribuce signálu citrátu v pozitivním MALDI-MSI (detekovaného jako [M+K]+) v sekcích jahod odpovídá skutečné koncentraci citrátu, nebo zda je obraz artefaktem způsobeným heterogenní distribucí draslíku. K tomu autoři použili multimodální přístup: MALDI-MSI (iMScope QT), následné LA-ICP-MSI na téže sekci pro zobrazení K, a kvantifikaci citrátu HPLC pomocí Nexera Organic Acid Analysis System na sousedních výřezech téhož vzorku.

Použitá metodika

• Vzorkování: zmrazené jahody (Fragaria × ananassa ‘Tochiotome’), řezy tloušťky 90 µm položeny na ITO-skleněné podložky.
• MALDI příprava: matrix 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) 30 mg/mL v 50 % MeOH s 0,2 % TFA, nanesená automatickým sprayerem iMLayer AERO (4 vrstvy).
• MALDI-MSI měření: pozitivní iontový režim, m/z 190–250, prostorové rozlišení (pitch) 50 µm; data zpracována v IMAGEREVEAL MS.
• LA-ICP-MSI: provedeno na téže sekci po MALDI analýze k zobrazení prostorového rozložení draslíku (m/z 39).
• Kvantifikace citrátu: excize 12 drobných kusů tkáně sousedních k sekci, extrakce vodou (70 °C 30 min), centrifugace a analyzování na Nexera Organic Acid Analysis System s vodivostní detekcí; kalibrace externími standardy (2.5–50 mg/L).

Použitá instrumentace

• MALDI-MSI: iMScope QT v kombinaci s LCMS-9050; matrix aplikátor iMLayer AERO.
• LA-ICP-MS: ICPMS-2050 s ablačním systémem imageBIO266 (laserová skenovací ablace, průměr štěti 55 µm, frekvence 1000 Hz).
• HPLC kvantifikace: Nexera Organic Acid Analysis System se sloupci Shim-pack SCR-102H, mobilní fáze 5 mmol/L p-toluensulfonové kyseliny, detekce vodivostní, teplota kolony 45 °C.
• Software pro MSI: IMAGEREVEAL MS pro analýzu dat z obou zobrazovacích přístrojů.

Hlavní výsledky a diskuse

• MALDI-MSI v pozitivním režimu detekoval citrát jako [M+K]+. Zobrazení ukázalo vyšší iontovou intenzitu citrátu v okrajových částech kůry (calyx-side) a nižší směrem k dřeni (pith).
• LA-ICP-MSI ukázalo, že draslík je koncentrován v zevní kůře a cévních svazcích, ale jeho prostorové rozložení se neshodovalo s rozložením citrátu zaznamenaným MALDI-MSI na téže sekci.
• Kvantitativní HPLC analýza 12 vyříznutých regionů potvrdila, že koncentrace citrátu je nejvyšší ve vnějších částech kůry a klesá směrem dovnitř — trend plně konzistentní s MALDI-MSI obrazy.
• Regresní analýza mezi HPLC kvantifikací a průměrnou iontovou intenzitou [M+K]+ ukázala velmi silnou korelaci (R² > 0.96), což indikuje lineární vztah mezi MALDI signálem a skutečnou koncentrací citrátu v analyzovaných regionech.
• Z těchto výsledků plyne, že v tomto experimentálním systému nejsou MALDI-MSI obrazy citrátu jako [M+K]+ zásadně zkreslené heterogenní distribucí draslíku; MALDI signál odráží skutečné prostorové rozložení citrátu.

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace molekulárního (MALDI-MSI) a elementárního (LA-ICP-MS) zobrazování spolu s kvantitativním HPLC poskytuje validní workflow pro ověření, zda aduktové signály v MSI skutečně reprezentují prostorové koncentrace analytů.
• Metoda umožňuje spolehlivou lokalizaci metabolitů v rostlinných tkáních, což je užitečné pro výzkum metabolismu, šlechtění plodin, hodnocení kvality potravin a studií rozložení živin.
• Integrovaná analýza v softwaru IMAGEREVEAL MS zjednodušuje porovnání dat z různých modalit a podporuje kvantitativní interpretace MSI obrazů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj metodiky směrem k absolutní kvantifikaci v MSI (na bázi interních standardů nebo korekcí ionizační účinnosti) zvýší kvantitativní přesnost prostorových analýz.
• Vyšší prostorové rozlišení a rychlejší hmotnostní analyzátory umožní mapování metabolitů na subbuněčné úrovni a studium heterogenity v menších tkáňových strukturách.
• Rozšíření multimodálních přístupů (např. kombinace MSI s optickým zobrazováním, Ramanem nebo FTIR) povede k komplexnějšímu chemickému charakterizování tkání.
• Vývoj softwaru pro fúzi dat a automatizovanou korelaci mezi modalitami usnadní interpretaci a zlepší reproducibilitu studií.

Závěr

Multimodální přístup spojující MALDI-MSI, LA-ICP-MSI a kvantitativní HPLC prokázal, že pozitivní MALDI signál citrátu jako [M+K]+ v řezech jahod skutečně odpovídá prostorovému rozložení citrátu, nikoli artefaktu způsobenému variabilní distribucí draslíku. Workflow předvádí robustní strategii pro validaci MSI výsledků a podporuje širší použití kombinovaných molekulárních a elementárních zobrazovacích technik v rostlinné analýze.

Reference

• Enomoto et al., J. Agric. Food Chem. 66: 4958-4965 (2018).