MULTIDIMENSIONAL LC-MS PLATFORMS FOR STRUCTURE-FUNCTION CHARACTERIZATION OF THERAPEUTIC ANTIBODIES

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou skupinu léčiv s vysokou účinností, ale zároveň s velkou strukturální složitostí a heterogenitou. Detailní charakterizace jejich struktury a funkce je nezbytná pro vývoj bezpečných a účinných bioterapeutik. Multidimenzionální LC-MS přístupy umožňují komplexní analýzu proteomu protilátek včetně jejich posttranslačních modifikací, agregace, oxidace a vazby na receptor FcRn.

Cíle a přehled studie / článku

Práce představuje vývoj a aplikaci 2D-, 3D- a víceúrovňových (multidimenzionálních) chromatograficko-hmotnostních platform pro detailní charakterizaci terapeutických monoklonálních protilátek. Hlavními cíli jsou:

• Optimalizace kombinace separačních režimů (RPLC, SEC, CEX, HIC, RP peptide map).
• Implementace online frakcionace (heart-cutting) a postupů redukce a digesce in-line.
• Hodnocení vlivu modifikací (oxidace, glykozylace, deamidace) na funkční vlastnosti, zejména FcRn vazbu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci byly využity následující přístroje a komponenty:

• Kapalinové chromatografy s více pumpami a selektory kolony pro 2D a 3D LC (Agilent, ThermoFisher).
• Kolony RPLC (Bio-mAb, AdvanceBio Peptide Map), SEC, CEX a HIC s vhodnými fázemi a optimálními teplotními/flow podmínkami.
• Online redukce a digesce trypsinem in-line pro získání bottom-up peptidových map.
• Q-TOF hmotnostní analyzátory pro vysoké rozlišení intact masek i peptidových fragmentů.
• UV (220–280 nm) a DAD detekce pro sledování eluce frakcí před MS detekcí.

Hlavní výsledky a diskuse

Multidimenzionální LC-MS přístupy prokázaly:

• Ve 2D RPLC×RPLC peptide mapách výrazné zvýšení rozlišení glykovaných a ne-glykovaných forem.
• Heart-cutting 2D LC-MS umožňuje selektivní přesměrování frakcí vysoké a nízké molekulové hmotnosti do sekundární dimenze pro detailní intact MS.
• 3D LC-MS s multi-method 2D fází kombinuje SEC, CEX a RP analýzu pro komplexní profilování náhradních variant a glykoform.
• MD-LC-MS (multi-dimenzionální) poskytlo >90% pokrytí sekvence protilátky v jediném běhu díky integrované online redukci a digesci.
• Různé oxidované varianty (M253, M429) byly lokalizovány pomocí RPLC×RPLC-MS a následně kvantifikovány v bottom-up a middle-up módu, což odhalilo vliv na FcRn vazbu.
• 2D-CEX-FcRn-MS umožňuje přímé spojení separace nabitých variant s nativní MS vazbou na receptor FcRn, což přineslo vhled do funkčního dopadu modifikací a oxidací.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace multidimenzionálních LC-MS metod v QC a výzkumu bioterapeutik umožňuje:

• Rychlé a komplexní profilování heterogenity protilátek v jedné analýze.
• Monitorování kvality a stability protilátek v různých fázích vývoje a výrobního procesu.
• Korelování strukturálních modifikací s funkčními vlastnostmi, zejména vazbou na FcRn a imunitními účinky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření multidimenzionálních metod s cílem:

• Integrace ion mobility separace pro rozlišení konformačních izomer.
• Využití pokročilých AI-řízených dekonvolučních algoritmů pro rychlejší zpracování MS dat.
• Automatizace end-to-end workflow od vzorku po report v GMP prostředí.
• Rozšíření aplikací na bispecifické protilátky a konjugáty (ADC).

Závěr

Multidimenzionální LC-MS platformy představují silný nástroj pro detailní strukturálně-funkční charakterizaci terapeutických protilátek. Kombinace různých chromatografických režimů s vysoce citlivou MS detekcí umožňuje komplexní analýzu intact molekul, middle-up i bottom-up fragmentů v jediném workflow. Takový holistický přístup významně zvyšuje kvalitu kontroly a urychluje vývoj nových bioterapeutik.

Reference

• Fekete S.; Guillarme D.; Sandra P.; Sandra K. Anal. Chem. 88 (2016) 480–507.
• Vanhoenacker G. et al. Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 355–366.
• Verscheure L. et al. Anal. Chem. 94 (2022) 6502–6511.
• Verscheure L. et al. J. Chromatogr. A 1653 (2021) 462409.
• Verscheure L. et al. J. Chromatogr. A 1726 (2024) 464947.
• Verscheure L. et al. Anal. Chem. 96 (2024) 18122–18131.