Optimizing Sample Preparation Protocols for Extraction of a Panel of PROTACs Molecules From Biological Fluids

Význam tématu

Proteolysis targeting chiméry neboli PROTAC molekuly představují novou generaci terapeutik zaměřených na cílenou degradaci bílkovin. Díky své heterobifunkční struktuře nabízejí možnost ovlivnit dříve nedostupné cíle. Pro jejich stanovení v biologických matricích je nezbytné vyvinout spolehlivé postupy pro extrakci a analýzu nízkých koncentrací v komplexních vzorcích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo systematicky optimalizovat protokoly přípravy vzorku pro panel šesti PROTAC molekul a příbuzných malých látek z biologických tekutin. Autoři porovnali běžné techniky od proteinové precipitace až po pevnou fázi včetně adsorbentů Oasis PRiME HLB a Oasis WAX. Hledali kompromis mezi vysokou výtěžností, redukcí matrice a možností plné automatizace.

Použitá instrumentace

• Chromatograf ACQUITY Premier UPLC
• Kolona ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8 µm, 2,1 x 100 mm
• Hmotnostní spektrometr Xevo TQ Absolute
• Softwarové nástroje MassLynx 4.2 a TargetLynx XS

Metodika

Pro extrakci vzorků byly otestovány tyto přístupy:

• Proteinová precipitace konvenčním způsobem a v 96destičkách Sirocco
• Ostro desky pro precipitaci a odstranění fosfolipidů
• Adsorbenty Oasis PRiME HLB a Oasis HLB
• Oasis WAX s postupem vývoje metodiky 2x4 pro optimalizaci elučních frakcí

Vzorky byly připravovány při teplotě 4 stupně C, chromatografické oddělení probíhalo při 60 stupních C s mobilní fází obsahující kyselinu mravenčí a formiát amonný.

Hlavní výsledky a diskuse

V testovaných postupech dosahovaly výtěžnosti PROTAC molekul přibližně 60 procent bez ohledu na techniku precipitace. Podstatným rozdílem byla účinnost odstranění fosfolipidů: Ostro a Oasis PRiME odstraňovaly kolem 98 procent, klasický Oasis HLB zhruba 88 procent. Nižší zbytková hladina fosfolipidů vedla k nižším matrickým efektům a stabilnějším výsledkům.
Optimalizace pomocí Oasis WAX mixed mode sorbentu přinesla výtěžnosti nad 90 procent pro většinu PROTAC molekul a téměř 100 procent pro související malé molekuly v neutrální eluční frakci.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované postupy umožňují:

• Rychlou přípravu vzorků pro screeningové aplikace v raných fázích vývoje léků
• Získání čistších extraktů s minimalizovanými matrickými efekty
• Dosažení vysoké citlivosti ve vývojových a klinických studiích při omezených objemech vzorků
• Plnou automatizaci přípravy vzorku pomocí robotických pipetovacích systémů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj sorbentů a automatizovaných platforem pro vysoce molekulární terapeutika. Integrované systémy pro on-line čištění a chromatografickou separaci by mohly dále zkrátit dobu analýzy a zvýšit propustnost v biomedicínském výzkumu i farmaceutické praxi.

Závěr

Studie ukazuje, že pro univerzální fit-for-purpose assay je vhodný Oasis PRiME HLB díky vysoké eliminaci fosfolipidů a solidní výtěžnosti. Pro dosažení maximální citlivosti je naopak ideální použití Oasis mixed mode WAX, které zajišťuje výtěžnosti nad 90 procent.

Reference

1. Tanna N et al. Application Note Waters Corporation, listopad 2024
2. Použité příručky a manuály Oasis PRiME HLB, Oasis WAX mixed mode