Parallel Column Regeneration for Increased Analytical Throughput of Serum Steroid Hormones in Clinical Research

Význam tématu

Analýza steroidních hormonů v lidské krvi vyžaduje vysokou chromatografickou selektivitu a propustnost vzhledem ke komplexitě matrice a požadavkům klinického výzkumu. Paralelní regenerace kolon umožňuje oddělit fázi separace od fáze reekvilibrace a výrazně tak zkrátit celkový čas analýzy bez kompromisů na kvalitě dat.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat přínos paralelní regenerace kolon pro kvantifikaci šesti steroidních hormonů (androstenedion, testosteron, 17-hydroxyprogesteron, dihydrotestosteron, dehydroepiandrosteron, progesteron) v lidské sérové matrici pomocí LC-MS/MS. Součástí bylo také ověření možnosti sdílené kalibrace mezi dvěma kolonnami a srovnání s klasickou single column metodou.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: ACQUITY UPLC I-Class PLUS SM-FL BSM/BSM Parallel Column Regeneration System (p/n: 176005409) s jedním čerpadlem a Xevo TQ-S Micro Tandem Mass Spectrometer v režimu pozitivní ESI a MRM.
• Příprava vzorků: využití 13C značených interních standardů, solid phase extraction dle upravené metodiky Waters application note 720006320, použití MassTrak Steroid Serum Cal Set 1 a QC Set 1.
• Chromatografické podmínky: kolona CORTECS UPLC C18 1.6 μm, 2.1×50 mm, teplota 50 °C; mobilní fáze A: 0.05 mM amonný fluorid (aq), B: methanol; objem vstřiku 20 μL, teplota autosampléru 8 °C, režim částečné smyčky.
• Paralelní režim: dvě identické kolony střídavě v režimu separace a regenerace, řízení pomocí dvou ventilů a dvou čerpadel.
• Statistická analýza: výpočet přímočarosti kalibrace (r ≥0.999 single, ≥0.997 paralelní), imprecision (RSD), rozšířená nejistota měření (95 % CI), EQA z-score, Studentův t-test.

Hlavní výsledky a diskuse

• Zkrácení cyklu analýzy z 7.2 na 6.1 minuty na vzorek (18% úspora času) – až 1.8 hodiny úspora pro 96 vzorků.
• Paralelní regenerace umožnila delší proplach a reekvilibraci offline kolony, což může zlepšit odstranění matrice a stabilitu raně eluovaných analytů.
• Imprecision ≤15 % RSD u všech hormonů, u DHT v nízkých koncentracích dokonce lepší výsledky v paralelním režimu.
• EQA vzorky vykázaly z-score mezi −2 a 2, Studentův t-test nepotvrdil statisticky významné rozdíly (p<0.05).
• Kalibrátory rozdělené mezi dvě kolony poskytly obdobné výsledky jako kompletní sada na jedné koloně, což umožňuje společnou kalibraci.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení propustnosti vzorků bez újmy na kvalitě a přesnosti měření.
• Optimalizace provozu chromatografické platformy v klinických laboratořích s vysokým objemem vzorků.
• Simplifikace zpracování dat díky možnosti sdíleného kalibračního modelu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další skupiny biologických analytů a integrovat do plně automatizovaných workflow s real-time monitoringem výkonnosti kolony. Dále je možné kombinovat paralelní regeneraci s vysokorychlostními screeningovými přístupy a rozšířit aplikaci na diagnostiku a toxikologii.

Závěr

Paralelní regenerace kolony významně zvyšuje throughput LC-MS/MS analýzy steroidních hormonů a zachovává vysokou kvalitu dat. Metoda je atraktivním řešením pro laboratoře s velkým počtem klinických vzorků, kde je klíčová rychlost a spolehlivost výsledků.

Reference

• Waters Corporation. Parallel Column Regeneration for Increased Analytical Throughput of Serum Steroid Hormones in Clinical Research. Application Note 720008639, December 2024.