Quantification of Ergosterol Using Microwave-Assisted Extraction and a Rapid 5-Minute Isocratic HPLC Method

Význam tématu

Ergosterol je klíčový biomarker všech hub, slouží jako indikátor kvality a prekurzor vitaminu D2 po UV ozáření. Vzhledem k rostoucímu zájmu o nutraceutika a funkční potraviny je rychlá a spolehlivá kvantifikace ergosterolu zásadní pro kontrolu kvality doplňků stravy, potravinářských výrobků a výzkum biologických účinků těchto sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout zjednodušenou, ekologičtější a přitom přesnou metodu pro kvantifikaci ergosterolu v extraktech z různých druhů hub. Klíčovým požadavkem bylo vyhnout se časově náročné saponifikaci a zkrátit chromatografickou analýzu na pět minut izokratického průtoku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla využita mikrovlnná extrakce v CEM Discovery 2.0 při 132 °C, 300 psi a 300 W po dobu 20 min v etanolovém prostředí. Extrakt byl filtrovaný, vysušený dusíkem a rekonstituován v etanolu s 10 % DMSO. Chromatografie probíhala na systému Arc Premier QSM-r s detekcí ACQUITY PDA 2998 při 280 nm. Kolona XBridge Premier BEH C18 (4,6×50 mm, 2,5 µm) při 60 °C, mobilní fáze 12:88 voda:acetonitril s 0,1 % kyselinou mravenčí, průtok 1 ml/min, injekce 10 µl.

Hlavní výsledky a diskuse

Screening dvou C18 kolon prokázal lepší separaci na XBridge BEH C18. Izokratická složka 88 % organika zajistila retenci ergosterolu mimo rušivé špičky z fronty kolony. Metoda dosáhla rozlišení >2,5 a faktor špičky 1,0. Spektrální čistotu špičky potvrdila analýza Peak Purity v Empower Software na 3D PDA datech. Kalibrace byla lineární v rozsahu 0,001–0,1 mg/ml (R2=0,999). Měřený obsah ergosterolu ve směsi hub představoval přibližně 305 mg/100 g sušiny.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění saponifikačního kroku zkracuje přípravu a snižuje chybovost.
• Izokratická metoda v délce 5 min snižuje spotřebu rozpouštědel a energetickou náročnost laboratoře.
• Aplikace v rutinním QA/QC laboratorním provozu pro kontrolu doplňků stravy a potravin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření mikrovlnné extrakce o automatizované vícevzorkové systémy, integrace superkritické fluidní extrakce pro vyšší výtěžnost, kombinace detekce PDA s hmotnostní spektrometrií pro širší profilování sterolů a standardizace metodik napříč průmyslem k vytvoření harmonizovaných norem pro funkční potraviny.

Závěr

Vyvinutá metoda spojuje rychlou mikrovlnnou extrakci bez saponifikace s pětiminutovou izokratickou HPLC analýzou. Zajišťuje vysokou přesnost, spektrální čistotu a linearitu měření ergosterolu v prakticky použitelném rozsahu, což umožňuje efektivní kontrolu kvality funkčních houbových přípravků.

Reference

1. Shao S., Hernandez M., Kramer J., Rinker D., Tsoa R. Ergosterol Profiles, Fatty Acid Composition, and Antioxidant Activities of Button Mushrooms as Affected by Tissue Part and Developmental Stage. J. Agric. Food Chem. 2010;58:11616–11625.
2. Yasukawa K., Aoki T., Takido M., Ikekawa T., Saito H., Matsukawa T. Inhibitory Effects of Ergosterol Isolated from the Edible Mushroom Hypsizius marmoreus on TPA-induced Inflammatory Ear Oedema and Tumor Promotion in Mice. Phytother. Res. 1994;62:10–13.
3. Yang J., Mills L., Nair G. Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant compounds from the mycelia of the edible mushroom Grifola frondosa. J. Agric. Food Chem. 2002;50:3479–3482.
4. Fan L., Pan H., Soccol T., Pandey A., Soccol R. Advances in mushroom research in the last decade. Food Technol. Biotech. 2006;44:303–311.
5. Ravi Subbiah T., Abplanalp W. Ergosterol (Major Sterol of Baker’s and Brewer’s Yeast Extract) Inhibits the Growth of Human Breast Cancer Cells in Vitro and the Potential Role of its Oxidation Products. Int. J. Vitam Nutr. Res. 2003;73:19–23.
6. Barreira J., Oliveira M., Ferreira I. Development of a Novel Methodology for the Analysis of Ergosterol in Mushrooms. Food Anal. Methods. 2014;7(1):DOI:10.1007/s12161-013-9621-9.
7. FDA. Food Additives Permitted for Direct Addition to Food for Human Consumption (Vitamin D2 Mushroom Powder) 21 C.F.R S172.382. U.S. Food and Drug Administration. 2020.
8. Papoutsis K., Grasso S., Menon A., Brunton N., Lyng J., Jacquier J., Bhuyan D. Recovery of Ergosterol and Vitamin D2 from Mushroom Waste – Potential Valorization by Food and Pharmaceutical Industries. Trends Food Sci. Technol. 2020;99:351–366.
9. Heleno S., Prieto M.A., Barros L., Rodrigues A., Barreiro M., Ferreira I. Optimization of Microwave Assisted Extraction of Ergosterol from Agaricus bisporus By-products Using Response Surface Methodology. Food Bioproducts Processing. 2016;100:25–35.
10. Phillips K., Ruggio D., Horst R., Minor B., Simon R., Feeney M., Byrdwell W., Haytowitz D. Vitamin D and Sterol Composition of 10 Types of Mushrooms from Retail Suppliers in the United States. J. Agric. Food Chem. 2001;59:7841–7853.