Peptide Mapping of an Antibody-Drug Conjugate Using PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit

Význam tématu

Peptidové mapování protilátka-lékových konjugátů (ADC) je klíčové pro potvrzení sekvence, určení míst konjugace a kontrolu kvality v biofarmaceutickém průmyslu. Vzhledem k rostoucímu významu ADC v cílené terapii je efektivní a reprodukovatelná metoda přípravy vzorku a analýzy nezbytná pro vývoj i kontrolu výroby.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo ukázat využití PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit pro rychlé, automovatelné peptidové mapování trastuzumabu a jeho ADC varianty trastuzumab-emtansine (T-DM1). Studie demonstruje identifikaci a charakterizaci peptidů konjugovaných malou molekulou drogou.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla použita sada PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit s recombinantním trypsinem RapiZyme. Digestion probíhala manuálně nebo na pipetovacím robotu Andrew+. Peptidy byly separovány na reverzní fázové kolóně XSelect Premier Peptide CSH C18 (2,1 × 150 mm, 2,5 µm) při teplotě 60 °C s gradientem 0,5–50 % organické fáze B (0,08 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu) po dobu 60 minut. Detekce probíhala UV při 252 nm a hmotnostní spektrometrií na přístroji Xevo G2 XS (ESI+, m/z 50–2000) s analýzou dat ve waters_connect softwaru.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy ADC ukázaly v porovnání s nekonjugovaným trastuzumabem další píky v pozdní retenci odpovídající hydrofobním konjugovaným peptidům. Mnohé byly potvrzeny MS daty jako peptidy nesené drogou a objevily se ve dvojicích (diastereomery) kvůli stereochemickým konfiguracím při konjugaci. Extrahované iontové chromatogramy pro m/z 616,27 (+3) a 923,90 (+2) potvrdily konjugaci na lyzinské zbytky v sekvenci light chain T16–17. MS/MS fragmentace pak lokalizovala vazebné místo na pátou aminokyselinu peptidu. Celkové sekvenční pokrytí dosáhlo 92 % u nezasahovaného trastuzumabu a až 98 % u T-DM1 při zohlednění blokovaných štěpných míst.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a plně automatable příprava vzorku pod 2,5 hodiny.
• Reprodukovatelné peptidové mapy pro mAbs i ADC.
• Citlivé rozlišení konjugovaných peptidů v chromatogramu i MS.
• Možnost lokalizace vazebných míst a identifikace diastereomerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k plné integraci s robotizovanými platformami pro vysokou propustnost, rozšíření na různé ADC formáty a vylepšenou softwarovou analýzu pro strukturovou charakterizaci a kvantifikaci konjugovaných variant. Rozšíření metodiky na QC testování a validaci postupů v GMP prostředí nabídne biotechnologickým firmám robustní nástroj pro kontrolu kvality.

Závěr

PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit představuje efektivní řešení pro peptidové mapování ADC s automatizovatelným workflow, které zkracuje dobu přípravy vzorku a zvyšuje reprodukovatelnost i sekvenční pokrytí. Metoda umožňuje detailní charakterizaci konjugovaných peptidů, včetně stereochemických variant.

Reference

• Hanna CM, Danaceau JP, Koza SM, Shiner S, Trudeau M. Quick and Robust Sample Preparation for Tryptic Peptide Mapping With the PeptideWorks Kit Using Simple, Automatable Workflows. Waters Application Note 720008019, July 2023.
• PeptideWorks Tryptic Protein Digestion Kit Care and Use Manual. Waters Corporation, Document 720007980, October 2024.
• RapiZyme Trypsin Care and Use Manual. Waters Corporation, Document 720007851, February 2023.
• Chen L, Wang L, Shion H, Yu C, Yu YQ, Zhu L, Li M, Chen W, Gao K. In-depth structural characterization of Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine) and its biosimilar candidate. MAbs 8(7):1210–1223, October 2016.
• Luo Q, Chung HH, Borths C, Janson M, Wen J, Joubert MK, Wypych J. Structural Characterization of a Monoclonal Antibody–Maytansinoid Immunoconjugate. Anal Chem 88(1):695–702, January 2016.