A high-throughput PROTAC compound screening workflow for targeted protein degradation with the Orbitrap Astral mass spectrometer for accurate label-free quantitation

Význam tématu

Proteinová degradace řízená malými molekulami PROTAC (Targeted Protein Degradation, TPD) otevírá nové možnosti ve vývoji léků tím, že neblokuje, ale odstraňuje škodlivé proteiny prostřednictvím ubiquitin-proteasomálního systému. Tato strategie se uplatňuje v onkologii, neurodegenerativních i infekčních onemocněních a vyžaduje rychlé, citlivé a kvantitativně přesné metody pro screening a validaci sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout ultra-vysokopropustný (high-throughput) workflow pro kvantitativní analýzu degradace proteinu androgenového receptoru (AR) v buňkách VCaP ošetřených PROTAC ARCC-4. Studie porovnává rychlé metody 300 a 180 vzorků/den (SPD) s metodami 60 a 24 SPD pro dosažení hlubokého proteomu, testuje linearitu, citlivost, reproducibilitu a selektivitu degradace AR.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: kultivační line VCaP ošetřené 5, 50 a 500 nM ARCC-4 po dobu 4 h, následná lyze, stanovení koncentrace proteinů BCA testem, digesce trypsinem.

• HPLC systém: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC.
• Kolony: IonOpticks Aurora Frontier TS 60×75 µm C18 (5 cm) pro 300 SPD; EASY-Spray PepMap Neo (50 cm) pro 24 SPD; PepMap (15 cm) pro 60 a 180 SPD.
• Mass spektrometr: Thermo Scientific Orbitrap Astral MS s DIA (narrow window DIA, 2 m/z okna).
• Gradienty: 3,5 min pro 300 SPD; 6,9 min pro 180 SPD; 22 min pro 60 SPD; 54 min pro 24 SPD.
• Data analysis: Spectronaut directDIA v19, DIA-NN v1.8.1, Proteome Discoverer 3.1 + CHIMERYS; FDR 1 % na PSM i proteiny.

Hlavní výsledky a diskuse

• Ultra-high-throughput metody 300 SPD identifikovaly ~8 322 proteinových skupin a ~55 861 peptidových skupin; 180 SPD ~8 705 proteiny a ~62 298 peptidů; CV biologických replik ~10 %.
• Extended gradient 60 SPD přinesl ~9 979 proteinů a ~133 379 peptidů; 24 SPD ~10 453 proteinů a ~142 000 peptidů.
• AR receptor degradován v závislosti na koncentraci ARCC-4 s DC50 ~30–40 nM při všech rychlostech.
• Počet AR peptidů: 14 (300 SPD), 36 (180 SPD), 41 (24/60 SPD), sdíleno 13 běžných peptidů.
• Výsledky ukazují konzistentní rychlost degradace AR, potvrzují citlivost, reprodukovatelnost a selektivitu Orbitrap Astral MS.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlé a přesné screenování velkého počtu PROTAC sloučenin.
• Zjištění on-target i off-target efektů v celém proteomu.
• Optimalizaci koncentrace sloučeniny a doby expozice na základě kvantitativních dat.
• Škálovatelnost od ultra-rychlého screeningu po detailní validaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace plně automatizovaných platforem pro přípravu vzorků a rychlé MS analýzy.
• Využití strojového učení pro výběr kandidátních sloučenin a predikci off-target interakcí.
• Rozšíření workflow na jiné degradátory a cílové proteiny v různých buněčných modelech.
• Kombinace s dalšími metodami (cross-linking, konformační MS) pro hlubší porozumění mechanismům degradace.

Závěr

Orbitrap Astral MS ve spojení s optimálními gradienty a DIA metodami poskytuje vysoce citlivou, přesnou a reprodukovatelnou platformu pro screening i validaci TPD sloučenin. Rychlé režimy 180/300 SPD umožňují identifikaci tisíců proteinů za den a delší režimy 24/60 SPD dosahují hlubokého proteomického pokrytí nezbytného pro detailní validaci.

Reference

1. Schapira M. et al. Nat Rev Drug Discov. 2019;18:949–963.
2. Chamberlain P.P., Hamann L.G. Nat Chem Biol. 2019;15:937–944.
3. Lv L. et al. eLife. 2020;9:e59994.
4. Li K., Crews C.M. Chem Soc Rev. 2022;51:5214–5236.
5. Mostofian B. et al. J Chem Inf Model. 2023;63(17):5408–5432.
6. Salami J. et al. Commun Biol. 2018;1:100.