Antibody subunit analysis via inline electrochemical reduction of an intact antibody using the ROXY potentiostat coupled to a Vanquish UHPLC – Q Exactive Plus MS system

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu bioterapeutik s vysokou specifičností. Přesná analýza disulfidových vazeb a posttranslačních modifikací je nezbytná pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv. Inline elektrochemická redukce integrovaná s UHPLC–HRAM MS umožňuje rychlou a efektivní přípravu vzorků bez potřeby enzymatického trávení či chemických redukčních činidel.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat kompletní elektrochemickou redukci intaktního NISTmAb v reálném čase. Použit byl ROXY Exceed potenciostat s μ-PrepCell SS a Vanquish Flex UHPLC spojený s Q Exactive Plus Orbitrap MS. Byla ověřena schopnost štěpit inter- i intrachain disulfidové vazby bez změny stávajících chromatografických podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

Inline elektrochemie:

• ROXY Exceed SCC potenciostat (Antec Scientific)
• μ-PrepCell SS dual-electrode flow-through cell s titanovým prací elektrodou

UHPLC–MS:

• Vanquish Flex Duo UHPLC s trap/release kolonkou
• Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
• MAbPac RP kolony (50 mm a 100 mm)
• Chromeleon CDS 7.2.10 a BioPharma Finder 4.1 pro řízení a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Inline redukce umožnila disociaci NISTmAb na lehký (Lc) a těžký (Hc) řetězec. Optimální redukce proběhla při impulzním režimu s E1=1 V, E2=0 V, t1=1 s a t2=0,1 s. Zvýšení teploty na 60 °C a přidání 20 % acetonitrilu zlepšily úplnost redukce. MS potvrdila posun hmotnosti +1 Da na každou interchain vazbu a +2 Da na intrachain vazbu, spolu s posunem charge state distribuí na vyšší nabití.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá redukce intaktních protilátek bez enzymů
• Zachování stávajících LC–MS metod
• Detailní charakterizace glykosylace a PTM na úrovni subjednotek
• Minimalizace času přípravy vzorku

Budoucí trendy a možnosti využití

Inline elektrochemie může najít široké uplatnění v rutinní QC bioterapeutik. Další optimalizace elektrodových materiálů, pulzních protokolů a kombinace s top-down přístupy může posílit selektivitu a umožnit komplexní mapování disulfidových vazeb a PTM.

Závěr

Inline elektrochemická redukce intaktních protilátek nabízí rychlou, plně automatizovatelnou a bezenzymatickou cestu k analýze subjednotek pomocí vysoce přesné LC–MS detekce. Metoda zkracuje dobu přípravy vzorku a minimalizuje riziko artefaktů.

Reference

• ICH Q11 a Q6B guidance, 1999–2012
• Morgan T. et al. Inline electrochemical reduction of NISTmAb for middle-up subunit LC-MS analysis. Analyst 2021.
• Nicolardi S. et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2013.
• Switzar L. et al. Liquid chromatography-electrochemistry-mass spectrometry for disulfide bond analysis. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2016.