A Modified GlycoWorks Procedure With Enhanced Detection Sensitivity

Význam tématu

Analýza N-vázané glykosylace představuje klíčový parametr kvality bioterapeutik, ovlivňující jejich farmakokinetiku, imunitní odpověď i biologickou aktivitu. Schopnost detekovat a kvantifikovat i nízkoodstupňové glykofrmy je nezbytná pro vývoj, kontrolu kvality a schvalování nových léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem této aplikace bylo upravit proceduru Waters GlycoWorks RapiFluor-MS tak, aby se zvýšila citlivost detekce fluorescenční (FLR) a hmotnostně-spektrometrické (MS) při analýze nízkoodstupňových N-glykánů, aniž by došlo ke zhoršení kvality dat či zvýšení složitosti práce. Upravený protokol byl srovnán se soupravou Agilent AdvanceBio Gly-X s barvivem InstantPC (IPC).

Použitá metodika a instrumentace

Enzymatické uvolnění N-glykánů z glykoproteinů (NISTmAb a fetuin) proběhlo pomocí PNGase F a surfaktantu RapiGest SF, následovalo značení RapiFluor-MS a čištění HILIC-SPE podle manuálu Waters GlycoWorks. Srovnávací metoda Agilent používala barvivo IPC a obdobný HILIC-SPE krok.
Instrumentace:

• UPLC: ACQUITY UPLC H-Class (FLR) a ACQUITY Premier UPLC (MS)
• Kolona: ACQUITY Premier Glycan BEH Amide, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 100 mm
• Detektory: FLR (λex/λem RFMS 265/425 nm, IPC 285/345 nm) a QToF Xevo G2-XS
• Podmínky MS: ESI+, 50–2000 m/z, teplota zdroje 120 °C, desolvace 300 °C, kapilára 3,00 kV

Hlavní výsledky a diskuse

Upravená GlycoWorks procedura s vyšší vstupní hmotností (40 µg vs. 15 µg) dosáhla přibližně trojnásobného nárůstu signálu ve FLR a dvojnásobného nárůstu SNR v MS bez změny relativního profilu glykánů. Srovnání s Agilent AdvanceBio Gly-X ukázalo, že při vyšším vstupu GlycoWorks poskytuje o 1,5× lepší FLR a 2,5× lepší MS citlivost a o 1,5× vyšší návratnost HILIC-SPE. U všech metod profil glykánů zůstal konzistentní. GlycoWorks navíc vykazoval 1,5–2× nižší míru přeznačkování (over-labelling) než IPC.

Přínosy a praktické využití metody

Upravený protokol umožňuje citlivou detekci nízkoodstupňových glykoforem, zvyšuje spolehlivost kvantifikace a minimalizuje chyby způsobené přeznačkováním. Metoda je rychlá (1–2 h), automatizovatelná a vhodná pro rutinní QC bioterapeutik i výzkumné laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Nadále se očekává integrace s automatizovanými kapalinovými a hmotnostními spektrometry vyšší generace, rozšíření aplikace na O-glykány a komplexní glykomické studie. Dále je perspektivní využití v on-line monitoringu výrobních procesů a v klinických studiích pro detailní charakterizaci glykoproteinů.

Závěr

Modifikovaná GlycoWorks RapiFluor-MS procedura významně zlepšuje citlivost FLR i MS detekce u nízkoodstupňových N-glykánů, zvyšuje výtěžek SPE čistění a snižuje přeznačkování. Tyto vlastnosti ji řadí mezi špičkové nástroje pro analýzu glykosylace bioterapeutik.

Reference

• Zhang P. et al. Challenges of glycosylation analysis and control: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs. Drug Discovery Today. 2016;21(5):740–765.
• Reusch D., Tejada M.L. Fc glycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes. Glycobiology. 2015;25(12):1325–1334.
• Goetze A.M. et al. High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology. 2011;21(7):949–959.
• Lauber M.A. et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent That Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection. Anal. Chem. 2015;87(10):5401–5409.
• Koza S.M. et al. Quality Control and Automation Friendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation. Waters Corp. 2020.
• Zhang X. et al. High-Throughput Analysis of Fluorescently Labeled N-Glycans Derived from Biotherapeutics Using an Automated LC-MS-Based Solution. SLAS Technology. 2020;24(4):380–387.
• Hanna C.M. et al. Automated RapiFluor-MS™ Labeled N-Glycan Sample Preparation for Protein A Purified Monoclonal Antibodies. Waters Corp. 2023.
• Kalkhof S., Sinz A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal Bioanal Chem. 2008;392:305–312.