RAPID PREPARATION OF RELEASED N-GLYCANS FOR HILIC ANALYSIS USING A NOVEL FLUORESCENCE AND MS-ACTIVE LABELING REAGENT

Význam tématu

Analýza N-glykanů je klíčová pro charakterizaci glykoproteinů v biotechnologii, farmaceutickém výzkumu i QA/QC procesech. Rychlé a citlivé stanovení uvolněných glykanů přispívá k lepšímu pochopení struktury, funkce a kvality biologických léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje novou metodiku pro přípravu uvolněných N-glykanů spojující rychlou deglykosylaci, fluorescenční a MS-aktivní značení pomocí reaktantu RapiFluor-MS a HILIC µElution SPE. Hlavním cílem je zkrátit dobu přípravy, zvýšit citlivost a zajistit kvantitativní obnovu glykanů.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorku zahrnuje tři kroky: rapidní deglykosylaci, značení a SPE clean-up. Deglykosylace probíhá pomocí Rapid PNGase F v přítomnosti surfaktantu RapiGest SF (1 % w/v), 80 °C, 2 min značení a 5 min inkubace při 50 °C.

• HILIC SPE: GlycoWorks µElution HILIC destička s aminopropyl silikou, kyselý wash pro odstranění nevyužitých reaktantů, eluční pufr 200 mM amonného acetátu v 5 % ACN.
• UPLC-FLR-MS: ACQUITY UPLC H-Class Bio s kolonkou BEH Amide 130 Å 1.7 µm (2.1×50 mm), teplota analytické kolony 60 °C, tok 0.4 mL/min, gradient Ammonium formiat/ACN, detekce FLR Ex 265/Em 425 nm.
• MS: Waters Synapt G2-S HDMS, ESI+ TOF (~20 K), capilární 3 kV, cone 80 V, rozsah 500–2500 m/z.

Hlavní výsledky a diskuse

RapiFluor-MS značení proběhne do 5 min a vytváří stabilní urea vazbu. Ve srovnání s analogem Instant AB dosahuje dvojnásobného fluorescenčního a až 780násobného MS signálu. Kompletní příprava od glykoproteinu po analyzovatelný vzorek trvá 30 min. Deglykosylace je dokončena za 5–10 min bez biasu pro různé typy glykanů. SPE obnovuje glykanové profily s vysokou kvantitativní přesností při jednom i dvou průchodech.

Přínosy a praktické využití metody

Výrazné zkrácení doby přípravy z hodin na desítky minut, zvýšená citlivost a robustnost usnadňují implementaci v rutinních provozech i výzkumných laboratořích. Metoda podporuje přesné profilování komplexních a tetrasialylovaných N-glykanů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je automatizace přípravy glykanů, integrace do vysokopropustných platforem a vývoj nových ionizaci podporujících reaktantů. Rozšíření aplikací na glykokomponenty buněčných receptorů a glykomiku v klinických studiích bude zásadní.

Závěr

Nový workflow založený na RapiFluor-MS reagenci, rychlé deglykosylaci a HILIC µElution SPE nabízí efektivní, citlivý a reprodukovatelný postup pro analýzu N-glykanů. Metoda významně zvyšuje přesnost a propustnost glykanové analýzy.

Reference

1. Mechref Y., Hu Y., Desantos-Garcia J. L., Hussein A., Tang H.: Quantitative glycomics strategies. Mol Cell Proteomics 2013, 12(4), 874–884.
2. Cook K. S., Bullock K., Sullivan T.: Development and qualification of an antibody rapid deglycosylation method. Biologicals 2012, 40(2), 109–117.
3. Klapoetke S., Zhang J., Becht S., Gu X., Ding X.: Profiling and identification of N-linked glycan with a procainamide tag by HPLC with fluorescent and mass spectrometric detection. J Pharm Biomed Anal 2010, 53(3), 315–324.