Quality Control and Automation Friendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation

Význam tématu

Profilování uvolněných N-glykanů je zásadní pro charakterizaci biotechnologických proteinů a terapeutických protilátek. Glykozylace ovlivňuje stabilitu, účinnost i imunogenicitu léčiv, a proto vyžaduje citlivé, rychlé a reprodukovatelné analytické postupy. RapiFluor-MS představuje štěpné značení, které umožňuje vysokou fluorescenční i MS citlivost a je vhodné pro nasazení ve vývoji i kvalitativní kontrole (QC) laboratoríích.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo upravit původní flexibilní protokol GlycoWorks RapiFluor-MS tak, aby všechny pipetované objemy byly ≥10 µL. Tím se minimalizuje variabilita způsobená chybou pipetování při nízkých objemech a je usnadněna automatizace a implementace v QC prostředí. Studie porovnala nové nastavení s dříve publikovanou metodou na standardním monoklonálním protilátkovém vzorku.

Použitá metodika

Postup zahrnoval:

• Denaturaci glykoproteinu ve 3% RapiGest SF (10 µL),
• Deglykozylaci pomocí PNGase F (10 µL),
• Značení N-glykanů reagensem RapiFluor-MS (10 µL),
• Ředění acetonitrilem a HILIC SPE čištění (celkem 400 µL),
• Chromatografii na ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide kolóně při 60 °C s gradientem vody/ammonium formiátu a acetonitrilu,
• Detekci fluorescencí (ex 265 nm, em 425 nm) a ESI-MS na Xevo G2-XS QTof (700–2000 m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání chromatogramů a kvantitativních profilů u Intact mAb Mass Check Standard ukázalo téměř identické retence a procentuální zastoupení jednotlivých glykanů, včetně stopových složek (≥0,06 %). Nový protokol dosahuje srovnatelné citlivosti a reprodukovatelnosti jako původní metoda přitom využívá větší pipetované objemy, což snižuje systematické a náhodné chyby pipetování.

Přínosy a praktické využití metody

Úprava protokolu přináší:

• Vyšší přesnost a preciznost pipetáže díky objemům ≥10 µL,
• Vhodnost pro automatizované platformy a rutinní QC laboratoře,
• Reprodukovatelné meziodborné i mezilaboratorní výsledky,
• Možnost zrychleného zpracování vzorků při zachování vysoké citlivosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody do plně automatizovaných pracovních stanic, adaptace na vysokokapacitní screening glykanů a kombinace s pokročilými MS technikami pro detailnější strukturální analýzu. Další vývoj se zaměří na multiplexní značení a rozšíření aplikace na O-glykanové struktury.

Závěr

Nově navržený protokol RapiFluor-MS pro automatizaci a QC s objemy ≥10 µL si zachovává analytické vlastnosti původní metody, přináší vyšší robustnost pipetování a je ideální pro rutinní kontrolu kvality i plně automatizované systémy. Doporučená koncentrace vzorku je 1,5 mg/mL (10 µL, tj. 15 µg glykoproteinu).

Použitá instrumentace

• GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit (Waters)
• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column, 1.7 µm, 2.1×150 mm
• ACQUITY UPLC FLR Detector (265/425 nm)
• Xevo G2-XS QTof Mass Spectrometer
• MassLynx Software v4.1

Reference

1. Lauber M. A. et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent. Waters App. Note 720005275EN, 2015.
2. Lauber M. A. et al. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection. Anal. Chem. 2015, 87, 5401–5409.
3. GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit Care and Use Manual (715004793).
4. Lauber M. A. et al. Robustness of RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparations and Glycan BEH Amide HILIC Chromatographic Separations. Waters App. Note 720005370EN, 2015.
5. ISO 8655-2:2002. Pipette performance – Part 2: Piston pipettes.