Quantification of a Lipid Conjugated Antisense Oligonucleotide (ASO) Extracted From Rat Plasma Using the OligoWorks™ SPE Microplate Kit on a HRMS System

Význam tématu

Oligonukleotidové léčivé látky představují perspektivní třídu terapeutik díky své schopnosti modulovat genovou expresi s vysokou specificitou a nízkou toxicitou. Bioanalytické laboratoře v rané fázi vývoje potřebují spolehlivé, rychlé a univerzální metody pro extrakci a kvantifikaci těchto látek z biologických matic, které zkracují dobu vývoje metod a zvyšují efektivitu screeningových procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit standardizovaný workflow pro extrakci lipidově konjugovaného antisense oligonukleotidu (ASO) z potkaní plazmy za použití OligoWorks SPE Microplate kitu a následnou kvantifikaci na LC-HRMS systému. Klíčovým aspektem bylo demonstrovat vysokou návratnost extrakce, nízké matrix efekty a univerzálnost metody pro objevné bioanalytické laboratoře.

Použitá metodika a instrumentace

Metodický postup zahrnoval:

• Sample preparation: Proteinázová digestace vzorků a SPE extrakce pomocí OligoWorks SPE Microplate kitu se dvěma optimalizovanými mycími kroky.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class PLUS systém s kolonkou Premier Oligonucleotide C18 (2.1×50 mm, 1.7 μm) při 55 °C, mobilní fáze A: 1 % HFIP/0,1 % DIPEA ve vodě, B: 0,75 % HFIP/0,0375 % DIPEA v organickém protředí (ACN/H2O).
• MS detekce: Xevo G3 QToF v ESI- modu, full scan m/z 50–2000, rozlišení umožňující úzké XIC okno 0,025 Da (prekurzor [M–9H+]– m/z 671,2297).
• Řízení a zpracování dat: waters_connect a UNIFI Scientific Information System.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizací složení mycího roztoku Wash 2 (10 % vs. 30 % methanolu) se dosáhlo výrazně lepší návratnosti cílového ASO (ačkoliv se interní standard choval odlišně). Úprava LC gradientu (25→75 % B během 3,25 min) zkrátila retenční dobu a zlepšila špičkovací profil. Volba XIC okna 0,025 Da vedla k optimálnímu poměru signál/šum. Kalibrační křivka byla lineární v rozsahu 1–1000 pmol/mL (r2 = 0,991) s přesností 87,8–114,2 % a CV 1,3–10,6 %. QC body (5, 50, 750 pmol/mL) splnily kritéria FDA s průměrnou přesností 98–113 % a CV <4 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizovaný, detergent-free SPE protokol šetří čas a náklady na vývoj metody.
• HRMS full scan přístup dovoluje univerzální akvizici pro různé oligonukleotidy a pozdější retrospektivní analýzu metabolitů.
• Metoda je vhodná pro vysokoprocesní screening v objevné fázi i pro podrobné ADME studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizovaných platform pro vyšší throughput a reprodukovatelnost.
• Rozšíření workflow na nové chemické modifikace oligonukleotidů a konjugátů.
• Použití HRMS dat pro necílenou metabolitovou analýzu a PK/PD modelování.

Závěr

Popsaná metoda pro extrakci lipidově konjugovaného ASO pomocí OligoWorks SPE Microplate kitu a kvantifikaci na Xevo G3 QToF HRMS splňuje požadavky na přesnost, citlivost a univerzálnost. Jednoduchá implementace a minimální vývojové požadavky činí tento workflow vhodným pro bioanalytické laboratoře podporující objevné i rané vývojové fáze terapeutických oligonukleotidů.

Reference

Nejsou k dispozici formální bibliografické reference z původního textu.