BIOANALYTICAL QUANTIFICATION OF A LIPID CONJUGATED ANTI-SENSE OLIGONUCLEOTIDE ON A HRMS SYSTEM

Význam tématu

Oligonukleotidová terapeutika představují rychle se rozvíjející oblast, jelikož umožňují cílenou modulaci genové exprese s vysokou specificitou a nízkou toxicitou. Spolehlivá bioanalytická kvantifikace lipidově konjugovaných antisense oligonukleotidů (ASO) je klíčová pro jejich vývoj od preklinických studií až po klinickou fázi. Zavedení standardizovaného, univerzálního pracovního postupu zvyšuje produktivitu laboratoří a snižuje náklady spojené s individuálním vývojem metodik.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem práce bylo vyvinout a validovat jednoduchý, ale citlivý a robustní workflow pro extrakci lipidově konjugovaného ASO z krevní plasmy potkana pomocí komerčního OligoWorks SPE Microplate kitu a následnou kvantifikaci na LC-HRMS systému. Studie představuje optimalizaci SPE protokolu, nastavení LC-HRMS analýzy a posouzení analytických parametrů včetně linearity, přesnosti a opakovatelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byl použit OligoWorks SPE Microplate Kit s polymerním WAX sorbentem. Po odběru plasmy následovaly kroky naložení, mytí (wash 1 a optimalizovaný wash 2) a eluace analyzátů. Chromatografie probíhala na ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System s BEH C18 kolonkou (2,1×50 mm, 1,7 μm, 130 Å), teplota kolony 55 °C, vzorek udržován při 10 °C. Mobilní fáze A: 1 % HFIP a 0,1 % DIPEA ve vodě; fáze B: 0,75 % HFIP, 0,0375 % DIPEA, 65 % acetonitril/35 % voda. Analytický systém: Xevo G3 QToF MS v negativním ESI módu, full scan m/z 50–2000, scan time 0,2 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace wash 2 kroku odhalila, že snížení organického podílu z 30 % na 10 % methanolu zvyšuje výtěžnost lipidového ASO (~80 %) na úkor vnitřního standardu (~60 %). Matricové efekty zůstaly pod 15 %. Kalibrační křivka v rozmezí 1–1000 pmol/mL vykázala koeficient determinace r2 = 0,991 s 1/x vážením. Rozsah přesnosti byl 87,8–114,2 % a koeficient variability 1,29–10,61 %. Kvalitativní kontrola LQC (5 pmol/mL), MQC (50 pmol/mL) a HQC (750 pmol/mL) prokázala přesnosti 98,19 %, 113,18 % a 106,24 % a CV 3,78 %, 0,85 % a 3,85 %. Vysoce rozlišená HRMS data umožnila testování XIC oken 0,7–0,01 Da, přičemž optimální poměr mezi šumem a signálem poskytlo okno 0,025 Da.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol nabízí univerzální postup použitelný pro široké spektrum oligonukleotidů, čímž eliminuje časově náročné individuální optimalizace. Kit-based přístup zaručuje reprodukovatelnost mezi laboratořemi a usnadňuje validaci podle regulačních směrnic. Untargeted akvizice na HRMS systému umožňuje zpětné zpracování dat pro identifikaci metabolit a rozšířenou charakterizaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj plně automatizovaných SPE platforem a miniaturizace vzorkovacích metod pro vysokopropustné analýzy. Integrace pokročilých softwarových nástrojů a umělé inteligence umožní efektivnější vyhodnocování HRMS dat a prediktivní modelování ADME vlastností ASO. Adaptace na nové modifikované oligonukleotidy a rozšíření aplikací do klinických farmakokinetických studií představují příští kroky.

Závěr

Navržený pracovní postup kombinuje komerční SPE kit a HRMS analýzu s univerzální akviziční metodou, která poskytuje citlivou, přesnou a opakovatelnou kvantifikaci lipidově konjugovaných ASO. Linearita, přesnost a variabilita splňují požadavky FDA bioanalytických směrnic, což zvyšuje efektivitu a konzistenci bioanalytických laboratoří.

Reference

• OligoWorks SPE Kits and Components—Care and Use Manual
• Quantification of a Lipid Conjugated Antisense Oligonucleotide (ASO) Extracted From Rat Plasma Using the OligoWorks SPE Microplate Kit on a HRMS System
• An Automated, Standardized, Kit-Based Sample Preparation Workflow for Bioanalytical Quantification of Therapeutic Oligonucleotides
• Development of a Standardized, Kit-Based Approach for Selective and Reproducible Sample Preparation and Extraction for Therapeutic Oligonucleotides from Biological Matrices