LC/MS Analysis of Lipid Composition in an mRNA LNP Formulation: A Stability Study

Význam tématu

mRNA vakcíny a terapeutika založená na lipidových nanočásticích (LNP) představují současný vrchol v dodávce nukleových kyselin. Stabilita a složení lipidové matric e LNP klíčově ovlivňují účinnost, bezpečnost a skladovatelnost těchto formulací. Cílené stanovení molárního poměru ionizovatelných lipidů, fosfolipidů, PEG-lipidů a cholesterolu je nezbytné pro zajištění konzistence výrobku, zejména v průběhu dlouhodobého skladování a lyofilizace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zavést a ověřit LC/MS metodu založenou na Agilent 1290 Infinity II LC a Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro přesnou kvantifikaci a identifikaci hlavních lipidových složek v mRNA LNP. Metoda byla použita k hodnocení vlivu různých skladovacích podmínek včetně mrazových teplot a lyofilizace za přítomnosti různých kryoprotektantů (sacharóza, trehalóza, mannitol).

Použitá metodika a instrumentace

Analýza byla provedena na sestavě Agilent 1290 Infinity II LC spojené s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.

• LC systém: Agilent 1290 Infinity II pumpa (G7120A), multikolonový termostat (G7116B), multisampler (G7167B)
• Hmotnostní spektrometr: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (G6549AA), pozitivní režim ESI
• Kolona: InfinityLab Poroshell 120 Phenyl-Hexyl, 2.1×50 mm, částice 1.9 µm
• Pohyblivé fáze: A – 90 % metanol/10 % 10 mM octan amonný; B – 90 % acetonitril/10 % 10 mM octan amonný, gradient 0–7 min od 100 % A k 100 % B
• Teplota kolony 55 °C, průtok 0.4 mL/min
• Software: MassHunter Workstation Data Acquisition v.11, Qualitative Analysis v.10

Pro kalibraci byly použity standardy SM-102, DMG-PEG 2K, DSPC a cholesterol v rozsahu 0.1–1000 pmol. LNP byly připraveny mísením ethanolu s lipidovou směsí a mRNA v sodném octanu (N : P poměr 5.67 : 1), následně buffer exchange na Tris pH 7.4 a koncentrace na ~4 mg/mL lipidů. Lyofilizace proběhla za přítomnosti kryoprotektantů při −40 °C s primárním sušením −55 °C a sekundárním sušením při 10 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky všech čtyř lipidů vykázaly v daném rozsahu vynikající linearitu (R2 ≥ 0.99). Metoda umožnila selektivní rozlišení lipidů s vysokou citlivostí a opakovatelností. U nelyofilizovaných vzorků se po 1 a 4 týdnech při −20 °C a −70 °C objevily změny molárních poměrů, zatímco lyofilizované částice zachovaly cílové složení v širokém rozmezí teplot (−70 °C až +4 °C) i po 12 týdnech. Nejstabilnější chování bylo pozorováno při použití sacharózy a mannitolu jako kryoprotektantů.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní kvantifikace lipidů poskytuje spolehlivý nástroj pro kontrolu kvality LNP
• Zajišťuje sledovatelnost výrobních šarží a konzistenci formulací
• Podpora vývoje stabilních mRNA vakcín a terapeutik
• Umožňuje optimalizaci lyofilizačního procesu a volby kryoprotektantů

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace LC/MS s vysokou propustností, automatizací odběru vzorků a pokročilou datovou analýzou (machine learning) přinese rychlejší screening formulací. Další rozvoj bude směřovat k miniaturizaci systémů, multiplexním detekcím a aplikacím na další typy nanocarrierů (polymery, dendrimerové systémy) a vizualizaci distribuce lipidů v biologických vzorcích.

Závěr

Popsaná LC/MS metoda na platformě Agilent 1290 Infinity II a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF poskytuje citlivou, přesnou a reprodukovatelnou analýzu lipidového složení mRNA LNP. Lyofilizace za vhodných podmínek významně zlepšuje stabilitu částic, čímž se prodlužuje jejich skladovatelnost a zajišťuje kvalita finálního výrobku.

Reference

• Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid Nanoparticles for mRNA Delivery. Nat Rev Mater. 2021;6:1078–1094.
• Gilleron J, Querbes W, Zeigerer A et al. Image-Based Analysis of Lipid Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery. Nat Biotechnol. 2021;31(7):638–646.
• Reichmuth AM, Oberli MA, Jaklenec A, Langer R, Blankschtein D. mRNA Vaccine Delivery Using Lipid Nanoparticles. Ther Deliv. 2016;7(5):319–334.
• Albertsen CH, Kulkarni JA, Witzigmann D et al. The Role of Lipid Components in Lipid Nanoparticles for Vaccines and Gene Therapy. Adv Drug Deliv Rev. 2022;188:114416.
• Jung HN, Lee S, Lee S et al. Lipid Nanoparticles For Delivery of RNA Therapeutics. Theranostics. 2022;12(17):7509–7531.
• Radomska‐Soukharev A. Stability of Lipid Excipients in Solid Lipid Nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev. 2007;59(6):411–418.
• Sommer U, Herscovitz H, Welty FK, Costello CE. LC-MS-Based Method for the Qualitative and Quantitative Analysis of Complex Lipid Mixtures. J Lipid Res. 2006;47(4):804–814.
• Varache M, Ciancone M, Couffin A-C. Development and Validation of a Novel UPLC-ELSD Method for the Assessment of Lipid Composition of Nanomedicine Formulation. Int J Pharm. 2019;566:11–23.
• Li Z, Schariter JA, Zhang J, Davis JC, Leone AM. Application of Ultra-high Performance Liquid Chromatography for Chemical Characterization of Liposome-based Therapeutic Small-interfering RNA. Am Pharm Rev. 2010;13:102.
• Fekete S, Doneanu C, Addepalli B et al. Challenges and Emerging Trends in Liquid Chromatography-Based Analyses of mRNA Pharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal. 2023;224:115174.
• Zhang L, Yang YY. Analysis of Lipid Nanoparticle Components Using an Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Agilent Technologies Application Note. 2024;5994-7520EN.